Gizakien eskeleto-muskulu-zuntzen heterogeneotasuna miosina-kate astunaren haratago

Eskerrik asko nature.com webgunea bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, arakatzailearen azken bertsioa erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea). Gainera, laguntza jarraitua bermatzeko, gune hau estilo eta JavaScript gabe egongo da.
Eskeleto-muskulua ehun heterogeneoa da, batez ere miofibrilez osatua, eta gizakietan hiru motatan sailkatzen dira normalean: bat "motela" (1 mota) eta bi "azkarrak" (2A eta 2X motak). Hala ere, miofibrila mota tradizionalen arteko eta barruko heterogeneotasuna oraindik ez da ondo ulertzen. Transkriptomiko eta proteomiko ikuspegiak aplikatu genizkien gizakien vastus lateralis-eko 1050 eta 1038 miofibrila indibiduali, hurrenez hurren. Ikerketa proteomikoak gizonak barne hartu zituen, eta ikerketa transkriptomikoak 10 gizon eta 2 emakume. Miosina-kate astuneko isoformez gain, proteina metabolikoak, erribosoma-proteinak eta zelulen lotura-proteinak identifikatu genituen miofibrila arteko aldakortasun multidimentsionalaren iturri gisa. Gainera, zuntz motel eta azkarren multzoak identifikatu arren, gure datuek iradokitzen dute 2X motako zuntzak fenotipikoki bereiztezinak direla beste zuntz azkarretatik. Gainera, miosina-kate astunean oinarritutako sailkapena ez da nahikoa nemalina miopatietan miofibrilen fenotipoa deskribatzeko. Oro har, gure datuek miozuntzen heterogeneotasun multidimentsionala iradokitzen dute, aldakuntza iturriak miosina kate astunaren isoformetatik haratago hedatzen direlarik.
Zelulen heterogeneotasuna sistema biologiko guztien berezko ezaugarria da, zelulei ehunen eta zelulen behar desberdinak asetzeko espezializatzea ahalbidetzen diena.1 Eskeleto-muskulu-zuntzen heterogeneotasunaren ikuspegi tradizionala izan da neurona motorrek definitzen dutela unitate motor baten barruko zuntz mota, eta zuntz mota (hau da, 1 mota, 2A mota eta 2X mota gizakietan) miosina-kate astuneko (MYH) isoformen ezaugarriek zehazten dutela.2 Hasieran, haien pH ATPasaren ezegonkortasunean oinarritu zen,3,4 eta geroago MYHren adierazpen molekularrean.5 Hala ere, MYH anitz proportzio desberdinetan batera adierazten dituzten "zuntz mistoak" identifikatu eta onartu ondoren, eskeleto-muskulu-zuntzak gero eta gehiago ikusten dira jarraipen gisa, zuntz mota bereizi gisa baino.6 Hala ere, arloak oraindik ere MYHren menpe dago miozuntzen sailkapenerako sailkatzaile nagusi gisa, ziurrenik karraskarien lehen ikerketen mugek eta alborapen esanguratsuek eraginda dagoen ikuspegia, zeinen MYHren adierazpen-profilak eta zuntz mota sorta gizakienetatik desberdinak diren.2 Egoera are gehiago konplikatzen da gizakien eskeleto-muskulu desberdinek zuntz mota sorta anitza erakusten dutelako.7 vastus lateralis MYH espresio-profil tartekoa (eta beraz, adierazgarria) duen muskulu mistoa da.7 Gainera, laginketa errazak gizakietan ondoen aztertutako muskulua bihurtzen du.
Beraz, funtsezkoa da gihar-zuntzen aniztasunaren ikerketa inpartziala "omika" tresna indartsuak erabiliz egitea, baina baita erronka bat ere, neurri batean gihar-zuntzen izaera multinukleatuaren ondorioz. Hala ere, transkriptomika8,9 eta proteomika10 teknologiek iraultza bat izan dute sentikortasunean azken urteotan, hainbat aurrerapen teknologikori esker, gihar eskeletikoaren analisia zuntz bakarreko bereizmenean ahalbidetuz. Ondorioz, aurrerapen nabarmenak egin dira zuntz bakarreko dibertsitatea eta estimulu atrofikoei eta zahartzeari ematen dioten erantzuna karakterizatzeko11,12,13,14,15,16,17,18. Garrantzitsua da aurrerapen teknologiko hauek aplikazio klinikoak dituztela, gaixotasunekin lotutako desregulazioaren karakterizazio zehatzagoa eta zehatzagoa ahalbidetuz. Adibidez, nemalina miopatiaren patofisiologia, giharretako gaixotasun hereditario ohikoenetako bat (MIM 605355 eta MIM 161800), konplexua eta nahasgarria da.19,20 Beraz, gihar-zuntzen desregulazioaren karakterizazio hobeago batek aurrerapen nabarmenak ekar ditzake gaixotasun honen ulermenean.
Giza biopsia laginetatik eskuz isolatutako eskeleto-muskulu-zuntz bakarren transkriptomiko eta proteomiko analisietarako metodoak garatu genituen eta milaka zuntzetan aplikatu genituen, giza eskeleto-muskulu-zuntzen zelulen heterogeneotasuna ikertzeko aukera emanez. Lan honetan zehar, muskulu-zuntzen transkriptomiko eta proteomiko fenotipazioen indarra frogatu genuen eta proteina metabolikoak, erribosomalak eta zelula-junturakoak identifikatu genituen zuntzen arteko aldakortasunaren iturri esanguratsu gisa. Gainera, proteomikoki lan-fluxu hau erabiliz, nematodoen miopatiaren garrantzi klinikoa karakterizatu genuen eskeleto-muskulu-zuntz bakarrean, zuntz motarekiko independenteak diren zuntz ez-oxidatzaileetarantz aldaketa koordinatu bat agerian utziz MYH-n oinarrituta.
Gizakien eskeleto-muskulu-zuntzen heterogeneotasuna ikertzeko, bi lan-fluxu garatu genituen eskeleto-muskulu-zuntz bakarren transkriptomaren eta proteomaren analisia ahalbidetzeko (1A irudia eta 1A irudi osagarria). Hainbat urrats metodologiko garatu eta optimizatu genituen, laginen biltegiratzetik eta RNA eta proteinen osotasuna kontserbatzetik hasi eta ikuspegi bakoitzerako errendimendua optimizatzeraino. Transkriptomaren analisiari dagokionez, hori lortu zen alderantzizko transkripzioaren hasierako urratsean lagin espezifikoen barra-kode molekularrak txertatuz, 96 zuntz biltzea ahalbidetuz ondorengo prozesamendu eraginkorra lortzeko. Zelula bakarreko ikuspegi tradizionalekin alderatuta, sekuentziazio sakonagoak (±1 milioi irakurketa zuntz bakoitzeko) transkriptomaren datuak aberastu zituen. 21 Proteomikarako, gradiente kromatografiko labur bat (21 minutu) erabili genuen DIA-PASEF datuen eskurapenarekin konbinatuta timsTOF masa-espektrometro batean proteomaren sakonera optimizatzeko, errendimendu handia mantenduz. 22,23 Eskeleto-muskulu-zuntz osasuntsuen heterogeneotasuna ikertzeko, 14 heldu-emaile osasuntsuren 1.050 zuntz indibidualen transkriptomak eta 5 heldu-emaile osasuntsuren 1.038 zuntzen proteomak karakterizatu genituen (1. taula osagarria). Lan honetan, datu-multzo hauei 1.000 zuntzeko transkriptoma eta proteoma deitzen zaie, hurrenez hurren. Gure metodoak guztira 27.237 transkripto eta 2.983 proteina detektatu zituen 1.000 zuntzeko transkriptomiko eta proteomiko analisietan (1A irudia, 1-2 datu-multzo osagarriak). Transkriptomiko eta proteomiko datu-multzoak 1.000 gene detektatu baino gehiago eta zuntz bakoitzeko % 50eko balio baliodunetarako iragazi ondoren, ondorengo bioinformatika-analisiak egin ziren transkriptoman eta proteoman dauden 925 eta 974 zuntzetarako, hurrenez hurren. Iragazi ondoren, batez beste 4257 ± 1557 gene eta 2015 ± 234 proteina (batez bestekoa ± SD) detektatu ziren zuntz bakoitzeko, banakako aldakortasun mugatuarekin (1B-C irudi osagarriak, 3-4 datu-multzo osagarriak). Hala ere, subjektu barruko aldakortasuna nabarmenagoa izan zen parte-hartzaileen artean, ziurrenik luzera eta zeharkako azalera desberdineko zuntzen arteko RNA/proteina etekinaren desberdintasunengatik. Proteina gehienentzat (>2000), aldakuntza-koefizientea % 20tik beherakoa izan zen (1D irudi osagarria). Bi metodoek transkripzio eta proteinen gama dinamiko zabala atzematea ahalbidetu zuten, giharren uzkurdurarako garrantzitsuak diren sinadura oso adieraziekin (adibidez, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (1E-F irudi osagarriak). Identifikatutako ezaugarri gehienak transkriptomiko eta proteomiko datu-multzoen artean komunak ziren (1G irudi osagarria), eta ezaugarri horien UMI/LFQ intentsitateen batez bestekoak nahiko ondo korrelazionatuta zeuden (r = 0,52) (1H irudi osagarria).
Transkriptomika eta proteomika lan-fluxua (BioRender.com-ekin sortua). BD MYH7, MYH2 eta MYH1-ren tarte dinamikoaren kurbak, eta zuntz motaren esleipenerako kalkulatutako atalaseak. E, F MYH espresioaren banaketa zuntzen artean transkriptomika eta proteomika datu-multzoetan. G, H Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP) grafikoak transkriptomika eta proteomikarako, MYH-n oinarritutako zuntz motaren arabera koloreztatuta. I, J Ezaugarri grafikoak MYH7, MYH2 eta MYH1 espresioa transkriptomika eta proteomika datu-multzoetan erakusten dituztenak.
Hasieran, MYH oinarritutako zuntz mota bakoitzari esleitzea erabaki genuen, omikako datu-multzoetan MYH espresioaren sentikortasun handia eta tarte dinamikoa aprobetxatzen dituen ikuspegi optimizatu bat erabiliz. Aurreko ikerketek atalase arbitrarioak erabili dituzte zuntzak 1 mota puru, 2A mota, 2X mota edo misto gisa etiketatzeko, MYH desberdinen espresio ehuneko finko batean oinarrituta11,14,24. Beste ikuspegi bat erabili genuen, non zuntz bakoitzaren espresioa zuntzak tipifikatzeko erabilitako MYHen arabera sailkatu zen: MYH7, MYH2 eta MYH1, 1 mota, 2A mota eta 2X motako zuntzei dagozkienak, hurrenez hurren. Ondoren, kurba bakoitzaren inflexio-puntua kalkulatu genuen matematikoki, eta atalase gisa erabili genuen zuntzak positibo (atalasearen gainetik) edo negatibo (atalasearen azpitik) gisa esleitzeko MYH bakoitzerako (1B-D irudia). Datu hauek erakusten dute MYH7-k (1B irudia) eta MYH2-k (1C irudia) espresio-profil bereizgarriagoak dituztela RNA mailan proteina mailarekin alderatuta. Izan ere, proteina mailan, oso zuntz gutxik ez zuten MYH7 adierazten, eta zuntz bakar batek ere ez zuen % 100eko MYH2 adierazpena. Ondoren, aurrez zehaztutako adierazpen-atalaseak erabili genituen MYH oinarritutako zuntz motak datu-multzo bakoitzeko zuntz guztiei esleitzeko. Adibidez, MYH7+/MYH2-/MYH1- zuntzak 1 motari esleitu zitzaizkion, eta MYH7-/MYH2+/MYH1+ zuntzak 2A/2X mota mistoari esleitu zitzaizkien (ikus 2. taula osagarria deskribapen osoa lortzeko). Zuntz guztiak batuz, MYH oinarritutako zuntz moten banaketa oso antzekoa ikusi genuen bai RNA (1E irudia) bai proteina (1F irudia) mailetan, eta MYH oinarritutako zuntz moten osaera erlatiboa aldatu egiten zen banakoen artean, espero bezala (2A irudi osagarria). Zuntz gehienak 1 mota puru (% 34-35) edo 2A mota (% 36-38) gisa sailkatu ziren, nahiz eta 2A/2X mota mistoko zuntz kopuru esanguratsu bat ere detektatu zen (% 16-19). Desberdintasun deigarri bat da 2X motako zuntz puruak RNA mailan bakarrik detektatu zitezkeela, baina ez proteina mailan, eta horrek iradokitzen du MYHren adierazpen azkarra gutxienez partzialki transkripzio osteko erregulatuta dagoela.
Gure proteomikan oinarritutako MYH zuntz tipifikatzeko metodoa balioztatu genuen antigorputzetan oinarritutako dot blotting erabiliz, eta bi metodoek % 100eko adostasuna lortu zuten 1 motako eta 2A motako zuntz puruak identifikatzerakoan (ikus 2B irudi osagarria). Hala ere, proteomikan oinarritutako ikuspegia sentikorragoa izan zen, eraginkorragoa zuntz nahasiak identifikatzeko eta zuntz bakoitzean MYH gene bakoitzaren proportzioa kuantifikatzeko. Datu hauek erakusten dute omikan oinarritutako ikuspegi objektibo eta oso sentikor bat erabiltzearen eraginkortasuna eskeleto-muskulu-zuntz motak karakterizatzeko.
Ondoren, transkriptomikak eta proteomikak emandako informazio konbinatua erabili genuen miozuntzak objektiboki sailkatzeko, haien transkriptoma edo proteoma osoaren arabera. Uniform manifold approximation and projection (UMAP) metodoa erabiliz dimentsioak sei osagai nagusitara murrizteko (3A-B irudi osagarriak), miozuntzen aldakortasuna transkriptoman (1G irudia) eta proteoman (1H irudia) bistaratu ahal izan genuen. Aipagarria da miozuntzak ez zirela parte-hartzaileen arabera (3C-D irudi osagarriak) edo proba-egunetan (3E irudi osagarria) taldekatu ez transkriptomika ez proteomika datu-multzoetan, eta horrek iradokitzen du eskeleto-muskulu-zuntzen subjektu barruko aldakortasuna subjektu arteko aldakortasuna baino handiagoa dela. UMAP grafikoan, "azkarrak" eta "motelak" diren miozuntzak adierazten dituzten bi multzo desberdin agertu ziren (1G-H irudiak). MYH7+ (moteleko) miozuntzak UMAP1-en polo positiboan multzokatu ziren, eta MYH2+ eta MYH1+ (azkarrak) miozuntzak, berriz, UMAP1-en polo negatiboan multzokatu ziren (1I-J irudiak). Hala ere, ez zen bereizketarik egin uzkurdura azkarreko zuntz moten artean (hau da, 2A mota, 2X mota edo 2A/2X mistoa) MYH espresioan oinarrituta, eta horrek iradokitzen du MYH1-en (1I-J irudia) edo beste 2X miozuntz markatzaile klasikoen adierazpenak, hala nola ACTN3 edo MYLK2-enak (4A-B irudi osagarriak), ez duela bereizten miozuntz mota desberdinen artean transkriptoma edo proteoma osoa kontuan hartuta. Gainera, MYH2 eta MYH7-rekin alderatuta, transkripto edo proteina gutxi zeuden positiboki korrelazionatuta MYH1-ekin (4C-H irudi osagarriak), eta horrek iradokitzen du MYH1-en ugaritasunak ez duela miozuntz transkriptoma/proteoma guztiz islatzen. Ondorio berdintsuetara iritsi ziren hiru MYH isoformen adierazpen mistoa UMAP mailan ebaluatzean (4I-J irudi osagarriak). Beraz, 2X zuntzak transkripzio mailan MYH kuantifikazioan bakarrik oinarrituta identifikatu daitezkeen arren, MYH1+ zuntzak ez dira beste zuntz azkarretatik bereizten transkripzioma edo proteoma osoa kontuan hartuta.
MYH-tik haratagoko zuntz motelen heterogeneotasunaren hasierako azterketa gisa, lau zuntz motel mota espezifikoko proteina ebaluatu genituen: TPM3, TNNT1, MYL3 eta ATP2A22. Zuntz motelen azpimotek Pearson korrelazio altuak erakutsi zituzten MYH7-rekin, bai transkriptomikan (5A irudi osagarria) bai proteomikan (5B irudi osagarria). Zuntz motelen % 25 eta % 33 inguru ez ziren zuntz motel puru gisa sailkatu transkriptomikan (5C irudi osagarria) eta proteomikan (5D irudi osagarria), hurrenez hurren, gene/proteina azpimota guztien arabera. Beraz, gene/proteina azpimota anitzetan oinarritutako zuntz motelen sailkapenak konplexutasun gehigarria dakar, zuntz mota espezifikoak direla ezagutzen diren proteinen kasuan ere. Horrek iradokitzen du gene/proteina familia bakar baten isoformetan oinarritutako zuntz sailkapenak ez duela behar bezala islatzen eskeleto-muskulu-zuntzen benetako heterogeneotasuna.
Gizakien eskeleto-muskulu-zuntzen aldakortasun fenotipikoa omika-eredu osoaren eskalan gehiago aztertzeko, datuen dimentsio-murrizketa inpartziala egin genuen osagai nagusien analisia (PCA) erabiliz (2A irudia). UMAP grafikoen antzera, ez parte-hartzaileak ez proba-eguna ez zuten zuntzen multzokatzean eraginik izan PCA mailan (6A-C irudi osagarriak). Bi datu-multzoetan, MYH-n oinarritutako zuntz mota PC2-k azaldu zuen, eta horrek 1 motako uzkurdura moteleko zuntzen multzo bat eta 2A motako uzkurdura azkarreko, 2X motako eta 2A/2X zuntz mistoak zituen bigarren multzo bat erakutsi zituen (2A irudia). Bi datu-multzoetan, bi multzo hauek 1/2A motako zuntz misto kopuru txiki batek lotuta zeuden. Espero bezala, PC eragile nagusien gainordezkaritzaren analisiak baieztatu zuen PC2 uzkurdura- eta metabolismo-sinadurek bultzatuta zegoela (2B irudia eta 6D-E irudi osagarriak, 5-6 datu-multzo osagarriak). Oro har, MYH oinarritutako zuntz mota nahikoa zela ikusi zen PC2-n zeharreko aldakuntza jarraitua azaltzeko, transkriptoman zehar kluster azkarrean banatuta zeuden 2X zuntz deiturikoak izan ezik.
A. Transkriptoma eta proteoma datu-multzoen osagai nagusien analisi (PCA) grafikoak, MYH-n oinarritutako zuntz motaren arabera koloreztatuta. B. PC2 eta PC1-en transkriptoma eta proteina gidarien aberaste-analisia. Analisi estatistikoa clusterProfiler paketea eta Benjamini-Hochberg-ek doitutako p-balioak erabiliz egin zen. C, D. Transkriptomako atxikimendu interzelularreko geneen ontologia (GO) terminoen eta proteomako kostamero GO terminoen arabera koloreztatutako PCA grafikoak. Geziek transkriptoma eta proteina gidariak eta haien norabideak adierazten dituzte. E, F. Klinikoki garrantzitsuak diren ezaugarrien hurbilketa eta proiekzio uniformearen (UMAP) ezaugarrien grafikoak, zuntz motela/azkarra motaren araberako espresio-gradienteak erakusten dituztenak. G, H. PC2 eta PC1 gidarien arteko korrelazioak transkriptometan eta proteometan.
Ustekabean, MYH-n oinarritutako miofibra motak bigarren aldakortasun mailarik altuena (PC2) baino ez zuen azaldu, eta horrek iradokitzen du MYH-n oinarritutako miofibra motarekin (PC1) zerikusirik ez duten beste faktore biologiko batzuek zeregin garrantzitsua dutela eskeleto-muskulu-zuntzen heterogeneotasuna erregulatzeko. PC1-eko eragile nagusien gehiegizko ordezkaritzaren analisiak agerian utzi zuen PC1-eko aldakortasuna batez ere zelula-zelulen atxikimenduak eta transkriptoman dauden erribosomen edukiak, eta proteoman dauden kostameroek eta erribosomen proteinek zehazten zutela (2B irudia eta 6D-E irudi osagarriak, 7. datu multzo osagarria). Eskeleto-muskuluan, kostameroek Z diskoa sarkolemarekin lotzen dute eta indar-transmisioan eta seinaleztapenean parte hartzen dute. 25 Zelula-zelulen atxikimenduaren (transkriptoma, 2C irudia) eta kostameroen (proteoma, 2D irudia) ezaugarriak erabiliz egindako PCA grafiko ohartuek ezkerreko desplazamendu sendoa agerian utzi zuten PC1-en, eta horrek adierazten du ezaugarri hauek zuntz jakin batzuetan aberastuta daudela.
UMAP mailan miozuntzen multzokatzearen azterketa zehatzago batek agerian utzi zuen ezaugarri gehienek miozuntzen azpimultzo espezifikoen ordez miozuntzen motaren araberako MYH-n oinarritutako espresio-gradiente bat erakusten zutela. Jarraitutasun hau baldintza patologikoekin lotutako hainbat genetan ikusi zen (2E irudia), hala nola CHCHD10 (gaixotasun neuromuskularra), SLIT3 (gihar-atrofia), CTDNEP1 (gihar-gaixotasuna). Jarraitutasun hau proteoman zehar ere ikusi zen, nahasmendu neurologikoekin (UGDH), intsulinaren seinaleztapenarekin (PHIP) eta transkripzioarekin (HIST1H2AB) lotutako proteinak barne (2F irudia). Datu hauek, oro har, zuntz motaren araberako uzkurdura motel/azkarraren heterogeneotasunean jarraitutasuna adierazten dute miozuntz desberdinetan.
Interesgarria da PC2-ko gidarien geneek transkriptoma-proteoma korrelazio ona erakutsi zutela (r = 0,663) (2G irudia), eta horrek iradokitzen du uzkurdura moteleko eta azkarreko zuntz motak, eta bereziki eskeleto-muskulu-zuntzen propietate uzkurgarri eta metabolikoak, transkripzionalki erregulatuta daudela. Hala ere, PC1-eko gidarien geneek ez zuten transkriptoma-proteoma korrelaziorik erakutsi (r = -0,027) (2H irudia), eta horrek iradokitzen du uzkurdura moteleko/azkarreko zuntz motekin zerikusirik ez duten aldakuntzak transkripzio osteko erregulazio handia dutela. PC1-eko aldakuntzak batez ere erribosomaren geneen ontologia terminoen bidez azaltzen zirenez, eta erribosomek zelulan funtsezko eta espezializatutako zeregina betetzen dutela kontuan hartuta, proteinen itzulpenean aktiboki parte hartuz eta eraginez,31 ondoren erribosomaren heterogeneotasun ustekabeko hau ikertzeari ekin genion.
Lehenik eta behin, proteomikaren osagai nagusien analisi grafikoa koloreztatu genuen GOCC "zitoplasma erribosoma" terminoan proteinen ugaritasun erlatiboaren arabera (3A irudia). Termino hau PC1-en alde positiboan aberastuta dagoen arren, gradiente txiki bat sortuz, erribosoma proteinek PC1-en bi norabideetan banatzea eragiten dute (3A irudia). PC1-en alde negatiboan aberastutako erribosoma proteinen artean RPL18, RPS18 eta RPS13 zeuden (3B irudia), eta RPL31, RPL35 eta RPL38 (3C irudia) PC1-en alde positiboan eragile nagusiak izan ziren. Interesgarria da, RPL38 eta RPS13 eskeleto-muskuluan beste ehunekin alderatuta asko adierazi zirela (7A irudi osagarria). PC1-en erribosoma sinadura bereizgarri hauek ez ziren transkriptoman ikusi (7B irudi osagarria), transkripzio osteko erregulazioa adieraziz.
A. Proteomaren zehar zitoplasmako erribosomaren geneen ontologiaren (GO) terminoen arabera koloreztatutako osagai nagusien analisi (PCA) grafikoa. Geziek PCA grafikoan proteinek eragindako aldakuntzaren norabidea adierazten dute. Lerroaren luzera proteina jakin baten osagai nagusiaren puntuazioari dagokio. B, C. RPS13 eta RPL38-ren PCA ezaugarrien grafikoak. D. Zitoplasmako erribosomaren proteinen multzokatze hierarkiko gainbegiratu gabeko analisia. E. 80S erribosomaren (PDB: 4V6X) egitura-eredua, eskeleto-muskulu-zuntzetan ugaritasun desberdina duten erribosomaren proteinak nabarmentzen dituena. F. mRNAren irteera-kanalaren ondoan lokalizatuta dauden estekiometria desberdina duten erribosomaren proteinak.
Erribosomen heterogeneotasun eta espezializazio kontzeptuak lehenago proposatu dira, eta horien arabera, erribosomen azpipopulazio desberdinen presentziak (erribosomen heterogeneotasuna) zuzenean eragin dezake proteinen itzulpenean ehun32 eta zelula33 desberdinetan, mRNA transkripzio multzo espezifikoen itzulpen selektiboaren bidez34 (erribosomen espezializazioa). Eskeleto-muskulu-zuntzetan ko-adierazitako erribosomen proteinen azpipopulazioak identifikatzeko, proteoman erribosomen proteinen multzokatze hierarkiko gainbegiratu gabeko analisi bat egin genuen (3D irudia, 8. datu multzo osagarria). Espero bezala, erribosomen proteinak ez ziren zuntz motaren arabera multzokatu MYH-n oinarrituta. Hala ere, erribosomen proteinen hiru multzo desberdin identifikatu genituen; lehenengo multzoa (erribosomen_multzoa_1) RPL38-rekin korregulatuta dago eta, beraz, adierazpen handiagoa du PC1 profil positiboa duten zuntzetan. Bigarren multzoa (erribosomen_multzoa_2) RPS13-rekin korregulatuta dago eta PC1 profil negatiboa duten zuntzetan altuagoa da. Hirugarren multzoak (erribosoma_multzoa_3) ez du espresio diferentzial koordinaturik erakusten eskeleto-muskulu-zuntzetan eta eskeleto-muskuluaren "nukleo" erribosoma-proteinatzat har daiteke. 1. eta 2. erribosoma-multzoek itzulpen alternatiboa erregulatzen dutela eta garapenean funtzionalki eragiten dutela frogatu den erribosoma-proteinak dituzte (adibidez, RPL10A, RPL38, RPS19 eta RPS25) eta garapenean funtzionalki eragiten dutela frogatu den erribosoma-proteinak dituzte (adibidez, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 PCA emaitzekin bat etorriz, erribosoma-proteina hauen zuntzetan zehar behatutako irudikapen heterogeneoak ere jarraitutasuna erakutsi zuen (7C irudi osagarria).
Erribosoman erribosoma barruko proteina erribosomal heterogeneoen kokapena bistaratzeko, gizakiaren 80S erribosomaren egitura-eredu bat erabili genuen (Protein Data Bank: 4V6X) (3E irudia). Erribosoma-multzo desberdinetako proteinak isolatu ondoren, haien kokapenak ez zeuden lerrokatuta, eta horrek iradokitzen du gure ikuspegiak ez zuela erribosomaren eskualde/frakzio batzuetarako aberastasuna lortzen. Interesgarria da, ordea, 2. multzoko azpiunitate handiko proteinen proportzioa 1. eta 3. multzoetakoa baino txikiagoa zela (7D irudi osagarria). Ikusi genuen eskeleto-muskulu-zuntzetan estekiometria aldatua zuten proteinak erribosoma-gainazalean lokalizatuta zeudela batez ere (3E irudia), mRNA populazio desberdinetako barne-erribosoma-sarrera guneko (IRES) elementuekin elkarreragiteko duten gaitasunarekin bat etorriz, eta horrela itzulpen selektiboa koordinatuz. 40, 41 Gainera, eskeleto-muskulu-zuntzetan estekiometria aldatua zuten proteina asko mRNAren irteera-tunelaren (3F irudia) bezalako eskualde funtzionalen ondoan zeuden, eta horiek peptido espezifikoen itzulpen-luzapena eta geldiaraztea selektiboki erregulatzen dute. 42 Laburbilduz, gure datuek iradokitzen dute eskeleto-muskuluko erribosoma-proteinen estekiometriak heterogeneotasuna duela, eta horrek eskeleto-muskulu-zuntzen arteko desberdintasunak eragiten dituela.
Ondoren, uzkurdura azkarreko eta moteleko zuntzen sinadurak identifikatzen eta haien transkripzio-erregulazioaren mekanismoak aztertzen hasi ginen. Bi datu-multzoetan UMAPek definitutako uzkurdura azkarreko eta moteleko zuntz-multzoak alderatuz (1G-H eta 4A-B irudiak), transkriptomiko eta proteomiko analisiek 1366 eta 804 ezaugarri ugari identifikatu zituzten, hurrenez hurren (4A-B irudiak, 9-12 datu-multzo osagarriak). Sarkomeroekin (adibidez, tropomiosina eta troponina), kitzikapen-uzkurdura akoplamenduarekin (SERCA isoformak) eta energia-metabolismoarekin (adibidez, ALDOA eta CKB) lotutako sinaduretan espero ziren desberdintasunak ikusi genituen. Gainera, proteinen ubikitinazioa erregulatzen duten transkripzioak eta proteinak modu desberdinean adierazi ziren uzkurdura azkarreko eta moteleko zuntzetan (adibidez, USP54, SH3RF2, USP28 eta USP48) (4A-B irudiak). Gainera, RP11-451G4.2 (DWORF) proteina-gene mikrobianoa, lehenago arkume-muskulu-zuntz motetan modu desberdinean adierazten dela frogatu dena43 eta bihotzeko muskuluan SERCA jarduera hobetzen duena44, nabarmen gorago erregulatu zen eskeleto-muskulu-zuntz moteletan (4A irudia). Era berean, zuntz bakoitzaren mailan, desberdintasun esanguratsuak ikusi ziren sinadura ezagunetan, hala nola metabolismoarekin lotutako laktato deshidrogenasa isoformetan (LDHA eta LDHB, 4C irudia eta 8A irudi osagarria)45,46, baita lehenago ezezagunak ziren zuntz mota espezifikoetan ere (IRX3, USP54, USP28 eta DPYSL3 bezalakoetan) (4C irudia). Ezaugarri desberdin adierazien gainjartze esanguratsua zegoen transkriptomiko eta proteomiko datu-multzoen artean (8B irudi osagarria), baita tolestura-aldaketaren korrelazio bat ere, batez ere sarkomeroen ezaugarrien adierazpen diferentzial nabarmenagoak bultzatuta (8C irudi osagarria). Azpimarratzekoa da sinadura batzuek (adibidez, USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) transkripzio osteko erregulazio sendoa maila proteomikoan bakarrik erakutsi zutela eta uzkurdura moteleko/azkarreko zuntz mota espezifikoen adierazpen profilak zituztela (8C irudi osagarria).
A eta B sumendi-diagramak, 1G-H irudietako UMAP hurbilketa eta proiekzio uniformearen bidez identifikatutako multzo motel eta azkarren alderaketan. Puntu koloreztatuek FDR < 0,05-en nabarmen desberdinak diren transkripzioak edo proteinak adierazten dituzte, eta puntu ilunagoek logaritmo-aldaketa > 1-en nabarmen desberdinak diren transkripzioak edo proteinak adierazten dituzte. Bi norabideko analisi estatistikoa DESeq2 Wald testa erabiliz egin zen, Benjamini-Hochberg-ek doitutako p balioekin (transkriptomika) edo Limma eredu linealaren metodoa erabiliz, analisi bayesiar enpirikoarekin, eta ondoren Benjamini-Hochberg-ek doitutako konparazio anitzekoetarako (proteomika). C Hautatutako gene edo proteinen sinadura-diagramak, zuntz motel eta azkarren artean. D Nabarmen desberdin adierazitako transkripzioen eta proteinen aberaste-analisia. Gainjarritako balioak bi datu-multzoetan aberasten dira, transkriptoma-balioak transkriptoma-n bakarrik aberasten dira, eta proteomaren balioak proteoman bakarrik aberasten dira. Analisi estatistikoa clusterProfiler paketea erabiliz egin zen, Benjamini-Hochberg-ek doitutako p balioekin. E. SCENICek identifikatutako zuntz mota espezifikoen transkripzio faktoreak, SCENICek lortutako erreguladoreen espezifikotasun puntuazioetan eta zuntz moten arteko mRNA adierazpen desberdinean oinarrituta. F. Zuntz motelen eta azkarren artean bereizita adierazten diren transkripzio faktore hautatuen profilaketa.
Ondoren, modu desberdinean ordezkatutako gene eta proteinen gainordezkaritza-analisi bat egin genuen (4D irudia, 13. datu-multzo osagarria). Bi datu-multzoen artean desberdinak ziren ezaugarrien bide-aberasteak espero ziren desberdintasunak agerian utzi zituen, hala nola gantz-azidoen β-oxidazio eta zetonen metabolismo-prozesuak (zuntz motelak), miofilamento/gihar uzkurdura (zuntz azkarrak eta motelak, hurrenez hurren) eta karbohidratoen prozesu katabolikoak (zuntz azkarrak). Serina/treonina proteina fosfatasaren jarduera ere handitu egin zen zuntz azkarretan, fosfatasa-azunitate erregulatzaile eta katalitikoek (PPP3CB, PPP1R3D eta PPP1R3A) bezalako ezaugarriek bultzatuta, glukogenoaren metabolismoa erregulatzen dutela ezagutzen baita (47) (8D-E irudi osagarriak). Zuntz azkarretan aberastutako beste bide batzuk proteoman prozesatzeko (P-) gorputzak (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (8F irudi osagarria), transkripzio osteko erregulazioan parte hartu dezaketenak (48), eta transkripzio faktoreen jarduera (SREBF1, RXRG, RORA) transkriptoman (8G irudi osagarria). Zuntz motelak oxidorreduktasa jardueran (BDH1, DCXR, TXN2) (8H irudi osagarria), amida loturan (CPTP, PFDN2, CRYAB) (8I irudi osagarria), matrize estrazelularra (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (8J irudi osagarria) eta hartzaile-ligando jardueran (FNDC5, SPX, NENF) (8K irudi osagarria) aberastu ziren.
Muskulu-zuntz motel/azkarraren ezaugarrien oinarrian dagoen transkripzio-erregulazioari buruzko informazio gehiago lortzeko, transkripzio-faktoreen aberastasun-analisia egin genuen SCENIC49 erabiliz (14. datu-multzo osagarria). Transkripzio-faktore asko nabarmen aberastu ziren muskulu-zuntz azkarren eta motelen artean (4E irudia). Honen artean, MAFA bezalako transkripzio-faktoreak zeuden, lehenago muskulu-zuntz azkarren garapenarekin lotu izan dena,50 baita muskulu-zuntz mota espezifikoen gene-programekin lehenago lotu ez ziren hainbat transkripzio-faktore ere. Horien artean, PITX1, EGR1 eta MYF6 izan ziren muskulu-zuntz azkarretan transkripzio-faktore aberastuenak (4E irudia). Aldiz, ZSCAN30 eta EPAS1 (HIF2A izenez ere ezaguna) izan ziren muskulu-zuntz moteletan transkripzio-faktore aberastuenak (4E irudia). Honekin bat etorriz, MAFA maila altuagoetan adierazi zen muskulu-zuntz azkarrei dagokion UMAP eskualdean, EPAS1ek kontrako adierazpen-eredua zuen bitartean (4F irudia).
Ezagutzen diren proteina kodetzaile geneez gain, hainbat RNA biotipo ez-kodetzaile daude, gizakien garapenaren eta gaixotasunen erregulazioan parte hartu dezaketenak. 51, 52 Transkriptoma datu-multzoetan, hainbat RNA ez-kodetzailek zuntz motaren espezifikotasuna erakusten dute (5A irudia eta 15. datu-multzo osagarria), LINC01405 barne, zuntz motelentzat oso espezifikoa dena eta miopatia mitokondriala duten pazienteen giharretan gutxitu dela jakinarazi dena. 53 Aldiz, RP11-255P5.3-k, lnc-ERCC5-5 geneari dagokiona (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, zuntz azkar motaren espezifikotasuna erakusten du. Bai LINC01405ek (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) bai RP11-255P5.3k (https://tinyurl.com/29jmzder) eskeleto-muskuluaren espezifikotasuna erakusten dute (9A-B irudi osagarriak) eta ez dute uzkurdura-gene ezagunik beren 1 Mb-ko auzo genomikoan, eta horrek iradokitzen du zuntz motak erregulatzen espezializatutako zeregina dutela, inguruko uzkurdura-geneak erregulatu beharrean. LINC01405 eta RP11-255P5.3-ren zuntz mota espezifikoen adierazpen-profil motela/azkarra, hurrenez hurren, RNAscope erabiliz baieztatu ziren (5B-C irudiak).
A. RNA transkripzio ez-kodetzaileak nabarmen erregulatuta daude uzkurdura moteleko eta azkarreko gihar-zuntzetan. B. RNAscope irudi adierazgarriak, LINC01405 eta RP11-255P5.3-ren uzkurdura moteleko eta azkarreko zuntz motaren espezifikotasuna erakusten dutenak, hurrenez hurren. Eskala-barra = 50 μm. C. RNAscope-k zehaztutako miofibra motaren araberako RNA ez-kodetzailearen adierazpenaren kuantifikazioa (n = 3 biopsia parte-hartzaile independenteetatik, banako bakoitzaren barruan gihar-zuntz azkarrak eta motelak alderatuz). Analisi estatistikoa bi isatseko Student-en t-test bat erabiliz egin zen. Kutxa-diagramek mediana eta lehenengo eta hirugarren kuartilak erakusten dituzte, biboteak balio minimo eta maximoetara seinalatzen dituztela. D. De novo proteina mikrobianoen identifikazio-lan-fluxua (BioRender.com-ekin sortua). E. LINC01405_ORF408:17441:17358 proteina mikrobianoa eskeleto-gihar-zuntz moteletan adierazten da espezifikoki (n = 5 biopsia parte-hartzaile independenteetatik, parte-hartzaile bakoitzaren gihar-zuntz azkarrak eta motelak alderatuz). Analisi estatistikoa Limm eredu linealaren metodoa erabiliz egin zen, ikuspegi bayesiar enpiriko batekin konbinatuta, eta ondoren Benjamini-Hochberg metodoa erabiliz p-balioaren doikuntzarekin konparaketa anitzak egiteko. Kaxa-diagramek mediana, lehen eta hirugarren kuartilak erakusten dituzte, biboteak balio maximo/minimoetara seinalatzen dituztela.
Duela gutxi, ikerketek erakutsi dute ustezko transkriptu ez-kodetzaile askok transkribatutako proteina mikrobianoak kodetzen dituztela, eta horietako batzuek muskulu-funtzioa erregulatzen dutela. 44, 55 Zuntz motaren espezifikotasun potentziala duten proteina mikrobianoak identifikatzeko, gure 1000 zuntz proteomaren datu-multzoa bilatu genuen, 1000 zuntz transkriptomaren datu-multzoan aurkitutako transkriptu ez-kodetzaileen sekuentziak (n = 305) dituen FASTA fitxategi pertsonalizatu bat erabiliz (5D irudia). 197 proteina mikrobiano identifikatu genituen 22 transkriptu desberdinetatik, eta horietatik 71 muskulu-zuntz eskeletiko motelen eta azkarren artean modu desberdinean erregulatuta zeuden (9C irudi osagarria eta 16. datu-multzo osagarria). LINC01405-erako, hiru proteina-produktu mikrobiano identifikatu ziren, eta horietako batek bere transkriptuarekiko zuntz motelen espezifikotasun antzekoa erakutsi zuen (5E irudia eta 9D irudi osagarria). Horrela, LINC01405 muskulu-zuntz eskeletiko motelentzat espezifikoa den proteina mikrobiano bat kodetzen duen gene gisa identifikatu genuen.
Muskulu-zuntz indibidualen proteomiaren karakterizazio eskala handiko lan-fluxu integral bat garatu genuen eta egoera osasuntsuetan zuntzen heterogeneotasunaren erregulatzaileak identifikatu genituen. Lan-fluxu hau aplikatu genuen nemalina miopatiek eskeleto-muskulu-zuntzen heterogeneotasunari nola eragiten dioten ulertzeko. Nemalina miopatiak muskulu-ahultasuna eragiten duten gaixotasun hereditarioak dira eta, kaltetutako haurrengan, hainbat konplikazio dituzte, besteak beste, arnasketa-arazoak, eskoliosia eta gorputz-adarren mugikortasun mugatua. 19,20 Normalean, nemalina miopatietan, aktina alfa 1 (ACTA1) bezalako geneetako aldaera patogenikoek uzkurdura moteleko zuntz miozuntzen osaeraren nagusitasuna eragiten dute, nahiz eta efektu hori heterogeneoa izan. Salbuespen nabarmen bat troponina T1 nemalina miopatia (TNNT1) da, zuntz azkarren nagusitasuna duena. Beraz, nemalina miopatietan behatutako eskeleto-muskulu-zuntzen desregulazioaren oinarrian dagoen heterogeneotasuna hobeto ulertzeak gaixotasun hauen eta miozuntz motaren arteko harreman konplexua argitzen lagun dezake.
Kontrol osasuntsuekin alderatuta (n=3 talde bakoitzeko), ACTA1 eta TNNT1 geneetan mutazioak zituzten nemalina miopatia zuten pazienteengandik isolatutako miozuntzek miozuntzen atrofia edo distrofia nabarmena erakutsi zuten (6A irudia, 3. taula osagarria). Honek erronka tekniko garrantzitsuak aurkeztu zituen analisi proteomikorako, eskuragarri zegoen material kopuru mugatua zelako. Hala ere, 2485 proteina detektatu ahal izan genituen 272 eskeleto-miozuntzetan. Zuntz bakoitzeko gutxienez 1000 proteina kuantifikatu iragazi ondoren, 250 zuntz ondorengo bioinformatika-analisia egin zitzaien. Iragazi ondoren, batez beste 1573 ± 359 proteina kuantifikatu ziren zuntz bakoitzeko (10A irudi osagarria, 17-18 datu-multzo osagarriak). Aipagarria da, zuntzen tamaina nabarmen murriztu arren, nemalina miopatia zuten pazienteen laginen proteomaren sakonera apur bat baino ez zela murriztu. Gainera, datu hauek gure FASTA fitxategiak erabiliz prozesatzeak (kodetzen ez duten transkripzioak barne) nemalina miopatia duten pazienteen eskeleto-miozuntzetan bost proteina mikrobiano identifikatzea ahalbidetu zigun (19. datu-multzo osagarria). Proteomaren barruti dinamikoa nabarmen zabalagoa zen, eta kontrol-taldeko proteina osoak ondo korrelazionatu ziren aurreko 1000 zuntzetako proteomaren analisi baten emaitzekin (10B-C irudi osagarria).
A. ACTA1 eta TNNT1 nemalina miopatietan (NM) zuntz atrofia edo distrofia eta zuntz mota desberdinen nagusitasuna MYH-n oinarrituta erakusten duten irudi mikroskopikoak. Eskala barra = 100 μm. ACTA1 eta TNNT1 pazienteen tindaketaren erreproduzigarritasuna bermatzeko, hiru pazienteen biopsiak bi edo hiru aldiz tindatu ziren (lau atal kasu bakoitzeko) irudi adierazgarriak hautatu aurretik. B. Zuntz motaren proportzioak parte-hartzaileetan MYH-n oinarrituta. C. Nemalina miopatiak dituzten pazienteen eta kontrolen eskeleto-muskulu-zuntzen osagai nagusien analisi (PCA) grafikoa. D. Nemalina miopatiak dituzten pazienteen eta kontrolen eskeleto-muskulu-zuntzak 2. irudian aztertutako 1000 zuntzetatik zehaztutako PCA grafiko batean proiektatuta. Adibidez, ACTA1 eta TNNT1 nemalina miopatiak dituzten parte-hartzaileen eta kontrolen arteko desberdintasunak alderatzen dituzten sumendi-grafikoak, eta ACTA1 eta TNNT1 nemalina miopatiak dituzten parte-hartzaileen arteko desberdintasunak alderatzen dituztenak. Zirkulu koloreztatuek π < 0,05ean nabarmen desberdinak ziren proteinak adierazten dituzte, eta puntu ilunek FDR < 0,05ean nabarmen desberdinak ziren proteinak. Analisi estatistikoa Limma eredu linealaren metodoa eta metodo bayesiar enpirikoak erabiliz egin zen, eta ondoren p-balioaren doikuntza egin zen konparazio anitzekoetarako Benjamini-Hochberg metodoa erabiliz. H. Proteoma osoan eta 1 eta 2A motako zuntzetan modu esanguratsuan adierazitako proteinen aberaste-analisia. Analisi estatistikoa clusterProfiler paketea eta Benjamini-Hochbergek doitutako p-balioak erabiliz egin zen. I, J. Osagai nagusien analisi (PCA) grafikoak matrize estrazelularraren eta mitokondrio-geneen ontologia (GO) terminoen arabera koloreztatuta.
Nemalina miopatiek MYH adierazten duten miofibra moten proportzioan eragina izan dezaketenez eskeleto-muskuluan,19,20 lehenik nemalina miopatiak dituzten pazienteen eta kontrolen MYH adierazten duten miofibra motak aztertu genituen. Miofibra mota zehaztu genuen 1000 miofibrako analisirako aurretik deskribatutako metodo inpartzial bat erabiliz (10D-E irudi osagarriak) eta berriro ere ez genuen lortu 2X miofibra puruak identifikatzea (6B irudia). Nemalina miopatien eragin heterogeneoa ikusi genuen miofibra motan, ACTA1 mutazioak zituzten bi pazientek 1 motako miofibra proportzio handiagoa baitzuten, eta TNNT1 nemalina miopatia zuten bi pazientek, berriz, 1 motako miofibra proportzio txikiagoa (6B irudia). Izan ere, MYH2 eta troponina azkarren isoformen (TNNC2, TNNI2 eta TNNT3) adierazpena gutxitu egin zen ACTA1-nemalina miopatietan, MYH7 adierazpena, berriz, gutxitu egin zen TNNT1-nemalina miopatietan (11A irudi osagarria). Hori bat dator nemalina miopatietan miozuntz mota heterogeneoen aldaketari buruzko aurreko txostenekin.19,20 Emaitza hauek immunohistokimikaren bidez baieztatu genituen eta ikusi genuen ACTA1-nemalina miopatia zuten pazienteen artean 1 motako miozuntzen nagusitasuna zegoela, eta TNNT1-nemalina miopatia zuten pazienteen artean kontrako eredua zegoela (6A irudia).
Zuntz proteomaren mailan, ACTA1 eta TNNT1 nemalina miopatia zuten pazienteen eskeleto-muskulu-zuntzak kontrol-zuntz gehienekin batera multzokatu ziren, TNNT1 nemalina miopatia zuten zuntzak izanik, oro har, kaltetuenak (6C irudia). Hori bereziki agerikoa zen paziente bakoitzerako zuntz pseudo-puztuen osagai nagusien analisi (PCA) grafikoak marraztean, TNNT1 nemalina miopatia zuten 2. eta 3. pazienteak kontrol-laginetatik urrunen agertuz (11B irudi osagarria, 20. datu multzo osagarria). Miopatia zuten pazienteen zuntzak zuntz osasuntsuekin nola alderatzen diren hobeto ulertzeko, parte-hartzaile heldu osasuntsuen 1.000 zuntzen analisi proteomikotik lortutako informazio zehatza erabili genuen. Miopatia datu-multzoko (ACTA1 eta TNNT1 nemalina miopatia zuten pazienteak eta kontrol-taldeak) zuntzak proiektatu genituen 1000 zuntzen analisi proteomikotik lortutako PCA grafikoan (6D irudia). Kontrol-zuntzetan MYH zuntz moten banaketa PC2 zehar 1000 zuntzeko proteomikaren analisitik lortutako zuntz banaketaren antzekoa izan zen. Hala ere, nemalina miopatia zuten pazienteen zuntz gehienak PC2 behera mugitu ziren, uzkurdura azkarreko zuntz osasuntsuekin gainjarriz, beren MYH zuntz mota natiboa edozein dela ere. Beraz, ACTA1 nemalina miopatia zuten pazienteen 1 motako zuntzetarantz desplazamendua erakutsi bazuten ere MYH oinarritutako metodoak erabiliz kuantifikatu zirenean, bai ACTA1 nemalina miopatiak bai TNNT1 nemalina miopatiak eskeleto-muskulu-zuntzen proteoma uzkurdura azkarreko zuntzetarantz mugitu zuten.
Ondoren, paziente talde bakoitza kontrol osasuntsuekin zuzenean alderatu genuen eta 256 eta 552 proteina bereizgarri identifikatu genituen ACTA1 eta TNNT1 nemalina miopatietan, hurrenez hurren (6E-G irudia eta 11C irudi osagarria, 21. datu multzo osagarria). Geneen aberastearen analisiak mitokondrio proteinen beherakada koordinatua agerian utzi zuen (6H-I irudia, 22. datu multzo osagarria). Harrigarria bada ere, ACTA1 eta TNNT1 nemalina miopatietan zuntz moten nagusitasun desberdina izan arren, beherakada hau guztiz independentea izan zen MYH-n oinarritutako zuntz motarekiko (6H irudia eta 11D-I irudi osagarriak, 23. datu multzo osagarria). Hiru proteina mikrobiano ere erregulatu ziren ACTA1 edo TNNT1 nemalina miopatietan. Mikroproteina horietako bik, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (LINC00598 edo Lnc-FOXO1 bezala ere ezaguna) eta ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), 1 motako miozuntzetan bakarrik erakutsi zuten ugaritasun desberdina. Aurretik jakinarazi da ENSG00000215483_TR14_ORF67-k zelula-zikloaren erregulazioan zeregina duela. 56 Bestalde, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798-ri dagokiona) handitu egin zen 1 eta 2A motako miozuntzetan ACTA1-nemalina miopatian, kontrol osasuntsuekin alderatuta (12A irudi osagarria, 24. datu multzo osagarria). Aldiz, erribosoma-proteinak ez ziren neurri handi batean eraginpean egon nemalina miopatian, nahiz eta RPS17 gutxitu egin zen ACTA1 nemalina miopatian (6E irudia).
Aberaste-analisiak sistema immunitarioaren prozesuen goranzko erregulazioa ere agerian utzi zuen ACTA1 eta TNNT1 nemalina miopatietan, zelulen atxikimendua ere handitu zen TNNT1 nemalina miopatian (6H irudia). Faktore estrazelular hauen aberastea islatu zen matrize estrazelularreko proteinek PCA norabide negatibo batean mugitzean (hau da, zuntz kaltetuenetarantz) (6J irudia). Bi paziente-taldeek erantzun immunitarioetan eta sarkolema konpontzeko mekanismoetan parte hartzen duten proteina estrazelularren adierazpena handitu zuten, hala nola anexinak (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 eta haien S100A1159 proteina elkarreragilea (12B-C irudi osagarriak). Prozesu hau lehenago jakinarazi da giharretako distrofietan hobetzen dela60, baina, dakigunez, ez da lehenago nemalina miopatiekin lotu. Makineria molekular honen funtzio normala beharrezkoa da lesio baten ondoren sarkolema konpontzeko eta miozito berrien eta miozuntzen fusiorako58,61. Beraz, bi paziente taldeetan prozesu honen jarduera handituak miozuntzen ezegonkortasunak eragindako lesioarekiko erantzun konpontzailea iradokitzen du.
Nemalina miopatia bakoitzaren efektuak ondo korrelazionatuta zeuden (r = 0,736) eta gainjartze arrazoizkoa erakutsi zuten (11A-B irudi osagarriak), eta horrek adierazten du ACTA1 eta TNNT1 nemalina miopatiak antzeko efektuak dituztela proteoman. Hala ere, proteina batzuk ACTA1 edo TNNT1 nemalina miopatian bakarrik erregulatu ziren (11A eta C irudi osagarriak). MFAP4 proteina profibrotikoa TNNT1 nemalina miopatian gehien erregulatu zen proteinetako bat izan zen, baina aldatu gabe jarraitu zuen ACTA1 nemalina miopatian. SKIC8, HOX genearen transkripzioa erregulatzeaz arduratzen den PAF1C konplexuaren osagai bat, TNNT1 nemalina miopatian gutxitu zen, baina ez zen ACTA1 nemalina miopatian eraginik izan (11A irudi osagarria). ACTA1 eta TNNT1 nemalina miopatiaren zuzeneko konparaketak mitokondrio-proteinen murrizketa handiagoak eta sistema immunologikoko proteinen igoerak agerian utzi zituen TNNT1 nemalina miopatian (6G-H irudia eta 11C eta 11H-I irudi osagarriak). Datu hauek bat datoz TNNT1 nemalina miopatian TNNT1 nemalina miopatiarekin alderatuta behatutako atrofia/distrofia handiagoarekin (6A irudia), eta horrek iradokitzen du TNNT1 nemalina miopatia gaixotasunaren forma larriagoa dela.
Nemalina miopatiaren efektu behatuak gihar maila osoan irauten duten ebaluatzeko, TNNT1 nemalina miopatia duten pazienteen kohorte bereko gihar biopsien proteomika masiboko analisi bat egin genuen eta kontrolekin alderatu genituen (n=3 talde bakoitzeko) (13A irudi osagarria, 25. datu multzo osagarria). Espero bezala, kontrolak estuki erlazionatuta zeuden osagai nagusien analisian, eta TNNT1 nemalina miopatia duten pazienteek lagin arteko aldakortasun handiagoa erakutsi zuten, zuntz bakarreko analisian ikusitakoaren antzekoa (13B irudi osagarria). Analisi masiboak zuntz indibidualak alderatuz nabarmendutako proteinak (13C irudi osagarria, 26. datu multzo osagarria) eta prozesu biologikoak (13D irudi osagarria, 27. datu multzo osagarria) erreproduzitu zituen, baina zuntz mota desberdinak bereizteko gaitasuna galdu zuen eta ez zuen zuntzen arteko gaixotasunaren efektu heterogeneoak kontuan hartu.
Datu hauek guztiek erakusten dute miofibra bakarreko proteomikak immunoblotting bezalako metodo zuzenduen bidez detektatu ezin diren ezaugarri biologiko klinikoak argitu ditzakeela. Gainera, datu hauek aktina zuntz tipifikazioa (MYH) bakarrik erabiltzearen mugak azpimarratzen dituzte egokitzapen fenotipikoa deskribatzeko. Izan ere, zuntz motaren aldaketa aktina eta troponina nemalina miopatien artean desberdina den arren, bi nemalina miopatiek MYH zuntz tipifikazioa eskeleto-muskulu-zuntzen metabolismotik deskonektatzen dute muskulu-proteoma azkarrago eta oxidazio gutxiagoko baterantz.
Zelulen heterogeneotasuna funtsezkoa da ehunek beren eskaera anitzak asetzeko. Eskeleto-muskuluan, hau askotan indar-ekoizpen eta neke-maila desberdinek ezaugarritzen dituzten zuntz mota gisa deskribatzen da. Hala ere, argi dago horrek eskeleto-muskulu-zuntzen aldakortasunaren zati txiki bat baino ez duela azaltzen, lehen uste baino askoz aldakorragoa, konplexuagoa eta alderdi anitzekoa baita. Aurrerapen teknologikoek eskeleto-muskulu-zuntzak erregulatzen dituzten faktoreak argitu dituzte orain. Izan ere, gure datuek iradokitzen dute 2X motako zuntzak agian ez direla eskeleto-muskulu-zuntz azpimota bereizi bat. Gainera, proteina metabolikoak, erribosoma-proteinak eta zelularekin lotutako proteinak identifikatu genituen eskeleto-muskulu-zuntzen heterogeneotasunaren determinatzaile nagusi gisa. Gure proteomika-lan-fluxua nematodoen miopatia duten pazienteen laginetan aplikatuz, frogatu genuen MYH-n oinarritutako zuntz-motak ez duela eskeleto-muskulu-heterogeneotasuna guztiz islatzen, batez ere sistema asaldatuta dagoenean. Izan ere, MYH-n oinarritutako zuntz mota edozein dela ere, nematodoen miopatiak zuntz azkarrago eta oxidazio gutxiagokoetara aldatzen du.
Eskeleto-muskulu-zuntzak XIX. mendetik sailkatu dira. Azken analisi omikek MYH zuntz mota desberdinen adierazpen-profilak eta estimulu desberdinekiko duten erantzuna ulertzen hasteko aukera eman digute. Hemen deskribatzen den bezala, omikako ikuspegiek abantaila dute zuntz mota markatzaileak kuantifikatzeko antigorputzetan oinarritutako metodo tradizionalak baino sentikortasun handiagoa izatea, markatzaile bakar baten (edo gutxi batzuen) kuantifikazioaren menpe egon gabe eskeleto-muskulu-zuntz mota bat definitzeko. Transkriptomikako eta proteomikako lan-fluxu osagarriak erabili genituen eta emaitzak integratu genituen gizakien eskeleto-muskulu-zuntzetan zuntz-heterogeneotasunaren transkripzio- eta transkripzio osteko erregulazioa aztertzeko. Lan-fluxu honek gure gizon gazte osasuntsuen kohortearen vastus lateralis-ean proteina-mailan 2X motako zuntz puruak identifikatzea ekarrarazi zuen. Hori bat dator aurreko zuntz bakarreko ikerketekin, vastus lateralis osasuntsuetan % 1 baino gutxiagoko 2X zuntz puruak aurkitu zituztenak, nahiz eta etorkizunean beste muskulu batzuetan baieztatu beharko litzatekeen. mRNA mailan ia 2X zuntz puruak detektatzearen eta proteina-mailan 2A/2X zuntz mistoak soilik detektatzearen arteko desadostasuna harrigarria da. MYH isoformaren mRNAren adierazpena ez da zirkadianoa,67 eta horrek iradokitzen du ez dugula litekeena MYH2ren hasiera-seinalea "galdu" izan 2X zuntz puruetan RNA mailan. Azalpen posible bat, hipotetiko hutsa bada ere, MYH isoformen arteko proteinen eta/edo mRNAren egonkortasunean dauden desberdintasunak izan litezke. Izan ere, ez dago zuntz azkarrik % 100 purua denik MYH isoforma bakar baterako, eta ez dago argi % 70-90eko tartean MYH1 mRNAren adierazpen-mailak MYH1 eta MYH2ren ugaritasun berdina ekarriko lukeen proteina mailan. Hala ere, transkriptoma edo proteoma osoa kontuan hartuta, kluster-analisiak konfiantzaz identifikatu ditzake eskeleto-muskulu-zuntz motelak eta azkarrak ordezkatzen dituzten bi kluster desberdin, haien MYHren osaera zehatza edozein dela ere. Hori bat dator nukleo bakarreko transkriptomikako ikuspegiak erabiltzen dituzten analisiekin, normalean bi mionukleo-kluster desberdin identifikatzen dituztenak. 68, 69, 70 Gainera, aurreko proteomikako ikerketek 2X motako zuntzak identifikatu badituzte ere, zuntz hauek ez dira gainerako zuntz azkarretatik bereizita multzokatzen eta MYH-n oinarritutako beste zuntz motekin alderatuta proteina kopuru txiki bat baino ez dute erakusten, ugariak baitira. 14 Emaitza hauek iradokitzen dute XX. mende hasierako gihar-zuntzen sailkapenaren ikuspegira itzuli beharko genukeela, zeinak gizakien eskeleto-gihar-zuntzak ez baitzituen hiru klase bereizitan banatzen MYH-n oinarrituta, baizik eta bi multzotan haien propietate metaboliko eta uzkurgarrietan oinarrituta. 63
Garrantzitsuagoa dena, miozuntzen heterogeneotasuna hainbat dimentsiotan kontuan hartu behar da. Aurreko "omika" ikerketek norabide horretan seinalatu dute, eskeleto-muskulu-zuntzek ez dituztela multzo diskretuak osatzen iradokiz, baizik eta jarraitutasun batean antolatuta daudela. 11, 13, 14, 64, 71 Hemen erakusten dugu, eskeleto-muskuluaren uzkurdura- eta metabolismo-propietateen desberdintasunez gain, miozuntzak zelula-zelula interakzioekin eta itzulpen-mekanismoekin lotutako ezaugarrien bidez bereiz daitezkeela. Izan ere, erribosomen heterogeneotasuna aurkitu dugu eskeleto-muskulu-zuntzetan, eta horrek heterogeneotasunean laguntzen du zuntz motel eta azkar motetatik independenteki. Miozuntzen heterogeneotasun nabarmen honen azpiko kausa, zuntz motel eta azkar motetatik independenteki, ez dago argi, baina gihar-faszikuluen barruko antolaketa espazial espezializatua adieraz dezake, indar eta karga espezifikoei modu optimoan erantzuten diena,72 gihar-mikroinguruneko beste zelula motekin zelula edo organo espezifikoen komunikazio espezializatua73,74,75 edo miozuntz indibidualen barruko erribosomen jardueran dauden desberdintasunak. Izan ere, erribosoma-heteroplasmia, RPL3 eta RPL3L-ren ordezkapen paralogoaren bidez edo rRNA-ren 2'O-metilazio mailan, eskeleto-muskuluaren hipertrofiarekin lotuta dagoela frogatu da76,77. Aplikazio multiomiko eta espazialak, miozuntz indibidualen karakterizazio funtzionalarekin konbinatuta, gihar-biologiaren ulermena are gehiago hobetuko dute maila multiomikoan78.
Nemalina miopatiak dituzten pazienteen miofibra bakarreko proteomak aztertuz, miofibra bakarreko proteomikaren erabilgarritasuna, eraginkortasuna eta aplikagarritasuna ere frogatu genuen eskeleto-muskuluaren patofisiologia klinikoa argitzeko. Gainera, gure lan-fluxua proteomika globalaren analisiarekin alderatuz, frogatu ahal izan genuen miofibra bakarreko proteomikak ehunen proteomika globalak adina informazio-sakonera ematen duela eta sakonera hori zabaltzen duela zuntzen arteko heterogeneotasuna eta miofibra mota kontuan hartuta. ACTA1 eta TNNT1 nemalina miopatietan kontrol osasuntsuekin alderatuta behatutako zuntz motaren erlazioan espero diren (aldakorrak izan arren) desberdintasunez gain,19 MYH-k eragindako zuntz motaren aldaketatik independenteki birmoldaketa oxidatiboa eta estrazelularra ere ikusi genuen. Fibrosia lehenago ere jakinarazi da TNNT1 nemalina miopatietan.19 Hala ere, gure analisiak aurkikuntza honetan oinarritzen da, ACTA1 eta TNNT1 nemalina miopatiak dituzten pazienteen miozuntzetan estresarekin lotutako proteina estrazelularrak, hala nola anexinak, sarkolema konpontzeko mekanismoetan parte hartzen dutenak, maila handituak ere agerian utziz.57,58,59 Ondorioz, nemalina miopatia duten pazienteen miozuntzetan anexina maila handituak miozuntz atrofiko larriak konpontzeko erantzun zelularra izan daiteke.
Ikerketa honek gizakien zuntz bakarreko gihar-omika osoko analisirik handiena adierazten badu ere, baditu mugak ere. Eskeleto-gihar zuntzak parte-hartzaileen lagin nahiko txiki eta homogeneo batetik eta gihar bakar batetik (vastus lateralis) isolatu genituen. Beraz, ezinezkoa da baztertzea gihar mota desberdinetan eta gihar fisiologiaren muturretan dauden zuntz-populazio espezifikoen existentzia. Adibidez, ezin dugu baztertu zuntz ultra-azkarretako azpimultzo bat (adibidez, 2X zuntz puruak) esprinter eta/edo indar-atletetan79 edo gihar-jarduerarik gabeko aldietan agertzea. Gainera, parte-hartzaileen lagin-tamaina mugatuak eragotzi zigun zuntzen heterogeneotasunean sexu-desberdintasunak ikertzea, zuntz moten ratioak gizonezkoen eta emakumezkoen artean desberdinak direla jakina baita. Gainera, ezin izan genituen transkriptomika eta proteomikako analisiak egin gihar-zuntz berdinetan edo parte-hartzaile berdinen laginetan. Guk eta beste batzuek zelula bakarreko eta miofibra bakarreko analisiak optimizatzen jarraitzen dugun heinean, analisi omikoa erabiliz lagin-sarrera ultra-txikia lortzeko (hemen mitokondrio-miopatia duten pazienteen zuntzen analisian erakusten den bezala), agerian geratzen da zuntz muskular bakarrean ikuspegi multiomikoak (eta funtzionalak) konbinatzeko aukera.
Oro har, gure datuek eskeleto-muskuluaren heterogeneotasunaren transkripzio- eta transkripzio osteko eragileak identifikatzen eta azaltzen dituzte. Zehazki, eskeleto-muskuluaren fisiologian zuntz moten MYH-n oinarritutako definizio klasikoarekin lotutako dogma zahar bat zalantzan jartzen duten datuak aurkezten ditugu. Eztabaida berritzea eta, azken finean, eskeleto-muskulu-zuntzen sailkapenaren eta heterogeneotasunaren ulermena birplanteatzea espero dugu.
Hamalau parte-hartzaile kaukasiar (12 gizon eta 2 emakume) borondatez onartu zuten ikerketa honetan parte hartzea. Ikerketa Ganteko Unibertsitate Ospitaleko Etika Batzordeak onartu zuen (BC-10237), 2013ko Helsinkiko Adierazpena bete zuen eta ClinicalTrials.gov-en erregistratu zen (NCT05131555). Parte-hartzaileen ezaugarri orokorrak 1. taula osagarrian ageri dira. Ahozko eta idatzizko baimena lortu ondoren, parte-hartzaileek azterketa medikoa egin zuten ikerketan sartu aurretik. Parte-hartzaileak gazteak ziren (22-42 urte), osasuntsuak (ez zuten osasun arazorik, ez zuten erretzeko historiarik) eta neurriz aktiboak fisikoki. Oxigeno-kontsumo maximoa mailaz mailako ergometro bat erabiliz zehaztu zen, aurretik deskribatu bezala, egoera fisikoa ebaluatzeko. 81
Muskulu-biopsia laginak atsedenaldian eta baraurik hiru aldiz bildu ziren, 14 eguneko tartearekin. Lagin hauek ikerketa handiago baten barruan bildu zirenez, parte-hartzaileek plazeboa (laktosa), H1 hartzaileen antagonista bat (540 mg fexofenadina) edo H2 hartzaileen antagonista bat (40 mg famotidina) kontsumitu zuten biopsia baino 40 minutu lehenago. Aurretik frogatu dugu histamina hartzaileen antagonista hauek ez dutela eragiten atsedenaldian dauden eskeleto-muskuluaren egoeran81, eta ez zen egoerarekin lotutako multzokatzea ikusi gure kalitate-kontrol grafikoetan (3. eta 6. irudi osagarriak). Dieta estandarizatu bat (41,4 kcal/kg gorputz-pisu, 5,1 g/kg gorputz-pisu karbohidrato, 1,4 g/kg gorputz-pisu proteina eta 1,6 g/kg gorputz-pisu gantz) mantendu zen esperimentu-egun bakoitzaren aurreko 48 orduetan, eta gosari estandarizatu bat (1,5 g/kg gorputz-pisu karbohidrato) kontsumitu zen esperimentu-egunaren goizean. Anestesia lokalaren pean (0,5 ml % 1 lidokaina epinefrinarik gabe), gihar-biopsiak lortu ziren vastus lateralis giharretik Bergström aspirazio perkutanea erabiliz.82 Gihar-laginak berehala txertatu ziren RNAlaterrean eta 4 °C-tan gorde ziren zuntz-disekzio eskuzkoa egin arte (gehienez 3 egun).
Miofibra sorta isolatu berriak RNAlater medio fresko batera transferitu ziren hazkuntza-plaka batean. Ondoren, miofibra indibidualak eskuz disekzionatu ziren estereomikroskopio bat eta pintza finak erabiliz. Biopsia bakoitzetik hogeita bost zuntz disekzionatu ziren, arreta berezia jarriz biopsiaren eremu desberdinetako zuntzak hautatzeari. Disekzioaren ondoren, zuntz bakoitza astiro-astiro murgildu zen 3 μl lisi-bufferrean (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad), proteinasa K eta DNasa entzimak zituena, nahi ez diren proteinak eta DNA kentzeko. Zelulen lisia eta proteina/DNA kentzea zurrunbilo labur baten bidez hasi ziren, likidoa mikrozentrifuga batean biraraziz eta giro-tenperaturan inkubatuz (10 min). Lisatua ziklo-makinan (T100, Bio-Rad) inkubatu zen 37 °C-tan 5 minutuz, 75 °C-tan 5 minutuz, eta berehala -80 °C-tan gorde zen prozesatu arte.
Illumina-rekin bateragarriak diren poliadenilatutako RNA liburutegiak 2 µl miofibra lisatutik prestatu ziren QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen) erabiliz. Metodo zehatzak fabrikatzailearen eskuliburuan aurki daitezke. Prozesua lehen katearen cDNA sintesiarekin hasten da alderantzizko transkripzioaren bidez, eta bertan identifikatzaile molekular bakarrak (UMI) eta lagin espezifikoetako i1 barra-kodeak sartzen dira laginen bilketa bermatzeko eta ondorengo prozesamenduan aldakortasun teknikoa murrizteko. Ondoren, 96 miofibrako cDNA bildu eta ale magnetikoekin purifikatzen da, ondoren RNA kendu eta bigarren katearen sintesia egiten da primer ausazkoekin. Liburutegia ale magnetikoekin purifikatzen da, multzo espezifikoetako i5/i7 etiketak gehitzen dira eta PCR bidez anplifikatzen dira. Azken purifikazio-urrats batek Illumina-rekin bateragarriak diren liburutegiak sortzen ditu. Liburutegi multzo bakoitzaren kalitatea High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500) erabiliz ebaluatu zen.
Qubit kuantifikazioan oinarrituta, multzoak kontzentrazio ekuimolarretan (2 nM) gehiago multzokatu ziren. Ondoren, lortutako multzoa NovaSeq 6000 tresna batean sekuentziatu zen modu estandarrean, NovaSeq S2 Reagent Kit-a (1 × 100 nukleotido) erabiliz, 2 nM-ko kargarekin (% 4 PhiX).
Gure pipeline-a Lexogen-en QuantSeq Pool datuen analisi pipeline-an oinarritzen da (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Datuak lehenik bcl2fastq2-rekin (v2.20.0) demultiplexatu ziren, i7/i5 indizean oinarrituta. 2. irakurketa idemux-ekin (v0.1.6) demultiplexatu zen, i1 laginaren barra-kodean oinarrituta, eta UMI sekuentziak umi_tools-ekin (v1.0.1) erauzi ziren. Irakurketak cutadapt-ekin (v3.4) moztu ziren hainbat txandatan, irakurketa laburrak (<20 luzera) edo egokitzaile-sekuentziez soilik osatutako irakurketak kentzeko. Irakurketak giza genomarekin lerrokatu ziren STAR (v2.6.0c) erabiliz, eta BAM fitxategiak SAMtools-ekin indexatu ziren (v1.11). Irakurketa bikoiztuak umi_tools (v1.0.1) erabiliz kendu ziren. Azkenik, lerrokatze-zenbaketa featureCounts erabiliz egin zen Subread-en (v2.0.3). Kalitate-kontrola FastQC (v0.11.9) erabiliz egin zen prozesuaren hainbat tarteko etapatan.
Bioinformatika prozesatzeko eta bistaratzeko gainerako guztia R-n egin zen (v4.2.3), batez ere Seurat (v4.4.0) lan-fluxua erabiliz.83 Beraz, UMI balio eta metadatu matrizeak Seurat objektu bihurtu ziren. Zuntz guztien % 30 baino gutxiagotan adierazitako geneak kendu ziren. Kalitate baxuko laginak kendu ziren 1000 UMI balio eta 1000 gene detektatutako gutxieneko atalase baten arabera. Azkenean, 925 zuntzek gainditu zituzten kalitate-kontroleko iragazketa-urrats guztiak. UMI balioak Seurat SCTransform v2 metodoa erabiliz normalizatu ziren,84 detektatutako 7418 ezaugarri guztiak barne, eta parte-hartzaileen arteko desberdintasunak erregresatu ziren. Metadatu garrantzitsu guztiak 28. datu-multzo osagarrian aurki daitezke.