Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du. Emaitza onenak lortzeko, arakatzaile berriago bat erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea). Bitartean, laguntza jarraitua bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScriptik gabe erakutsiko dugu.
Aldaketa modikoaren (MC) animalia-ereduak ezartzea oinarri garrantzitsua da MC aztertzeko. Berrogeita hamalau untxi zuri Zeelanda Berrian banatu ziren ebakuntza faltsuko taldean, gihar-inplantazio taldean (ME taldea) eta nukleo pulposoaren inplantazio taldean (NPE taldea). NPE taldean, ornoarteko diskoa gerrialdeko kirurgia anterolateralaren bidez agerian geratu zen eta orratz bat erabili zen L5 orno-gorputza zulatzeko, muturreko plakaren ondoan. NP L1/2 ornoarteko diskotik xiringa batekin atera eta bertan injektatu zen. Zulo bat egitea hezur subkondralean. Gihar-inplantazio taldean eta ebakuntza faltsuko taldean kirurgia-prozedurak eta zulaketa-metodoak NP inplantazio taldekoen berdinak izan ziren. ME taldean, gihar zati bat jarri zen zuloan, eta ebakuntza faltsuko taldean, berriz, ez zen ezer jarri zuloan. Ebakuntzaren ondoren, MRI eskaneatzea eta proba biologiko molekularrak egin ziren. Seinalea aldatu zen NPE taldean, baina ez zen seinale-aldaketa nabarmenik egon ebakuntza faltsuko taldean eta ME taldean. Behaketa histologikoak erakutsi zuen ehunen ugalketa anormala ikusi zela inplantazio-gunean, eta IL-4, IL-17 eta IFN-γ-ren adierazpena handitu egin zela NPE taldean. NP hezur subkondralean inplantatzeak MC-ren animalia-eredu bat osa dezake.
Aldaketa modikoak (AM) ornoen muturreko plaken eta ondoko hezur-muineko lesioak dira, erresonantzia magnetiko bidezko irudietan (EM) ikusten direnak. Nahiko ohikoak dira sintomak dituzten pertsonengan1. Ikerketa askok azpimarratu dute AMren garrantzia, bizkarreko beheko minarekin (LBP) duen loturagatik2,3. de Roos et al.4 eta Modic et al.5 izan ziren, modu independentean, ornoen hezur-muineko hiru seinale subkondral anomalia mota desberdin deskribatu zituzten lehen aldiz. I motako aldaketa modikoak hipointensoak dira T1-pisatutako (T1W) sekuentzietan eta hiperintensoak T2-pisatutako (T2W) sekuentzietan. Lesio honek fisura-muturreko plakak eta ondoko granulazio-ehun baskularra agerian uzten ditu hezur-muinean. II motako aldaketa modikoek seinale altua erakusten dute T1W eta T2W sekuentzietan. Lesio mota honetan, muturreko plaken suntsipena aurki daiteke, baita ondoko hezur-muinaren ordezkapen histologikoa ere. III motako aldaketa modikoek seinale baxua erakusten dute T1W eta T2W sekuentzietan. Muturreko plakei dagozkien lesio esklerotikoak ikusi dira6. MC bizkarrezurraren gaixotasun patologikotzat hartzen da eta bizkarrezurraren endekapenezko gaixotasun askorekin estuki lotuta dago7,8,9.
Eskuragarri dauden datuak kontuan hartuta, hainbat ikerketek MCren etiologia eta mekanismo patologikoei buruzko ikuspegi zehatza eman dute. Albertek eta beste batzuek iradoki zuten MC disko-herniazioa izan daitekeela8. Huk eta beste batzuek MC disko-endekapen larriari egotzi zioten10. Krocek "barne disko-hausturaren" kontzeptua proposatu zuen, eta horrek dio disko-traumatismo errepikakorrek mikrourradurak sor ditzaketela muturreko plakan. Arraildura eratu ondoren, nukleo pulposoak (NP) muturreko plaka suntsitzeak erantzun autoimmune bat eragin dezake, eta horrek MC11ren garapena dakar. Mak eta beste batzuek antzeko ikuspegia partekatu zuten eta jakinarazi zuten NPk eragindako autoimmunitateak funtsezko zeregina duela MC12ren patogenian.
Sistema immuneko zelulek, batez ere CD4+ T laguntzaile linfozitoek, funtsezko zeregina dute autoimmunitatearen patogenian13. Duela gutxi aurkitu den Th17 azpimultzoak IL-17 zitokina proinflamatorioa sortzen du, kimiokinen adierazpena sustatzen du eta organo kaltetuetan T zelulak estimulatzen ditu IFN-γ14 ekoizteko. Th2 zelulek ere zeregin berezia dute erantzun immuneen patogenian. IL-4 Th2 zelula adierazgarri gisa adierazteak ondorio immunopatologiko larriak ekar ditzake15.
MC16,17,18,19,20,21,22,23,24-ri buruzko ikerketa kliniko asko egin diren arren, oraindik ez dago gizakiengan maiz gertatzen den MC prozesua imitatu dezaketen eta etiologia edo terapia zuzendua bezalako tratamendu berriak ikertzeko erabil daitezkeen animalia-eredu esperimental egokirik. Gaur arte, MCren animalia-eredu gutxi batzuk baino ez dira jakinarazi azpiko mekanismo patologikoak aztertzeko.
Albert eta Ma-k proposatutako teoria autoimmunean oinarrituta, ikerketa honek untxi MC eredu sinple eta erreproduzigarri bat ezarri zuen, NP autotransplantatuz orno-muturreko plaka zulatutik gertu. Beste helburu batzuk animalia-ereduen ezaugarri histologikoak behatzea eta NP-k MCaren garapenean dituen mekanismo espezifikoak ebaluatzea dira. Horretarako, biologia molekularra, MRI eta azterketa histologikoak bezalako teknikak erabiltzen ditugu MCaren progresioa aztertzeko.
Bi untxi hil ziren odoljarioz ebakuntzan zehar, eta lau untxi hil ziren erresonantzia magnetikoan zehar anestesia egin zitzaiola. Gainerako 48 untxiak bizirik iraun zuten eta ez zuten portaera- edo neurologia-seinalerik erakutsi ebakuntzaren ondoren.
MRIak erakusten du zulo ezberdinetan txertatutako ehunaren seinale-intentsitatea desberdina dela. NPE taldeko L5 orno-gorputzaren seinale-intentsitatea pixkanaka aldatu zen txertatu eta 12, 16 eta 20 astera (T1W sekuentziak seinale baxua erakutsi zuen, eta T2W sekuentziak seinale mistoa gehi seinale baxua) (1C irudia), eta txertatutako beste bi taldeen MRI itxura nahiko egonkorra mantendu zen aldi berean (1A eta B irudiak).
(A) Untxiaren gerri-bizkarrezurraren MRI sekuentzial adierazgarriak 3 denbora-puntutan. Ez zen seinale-anomaliarik aurkitu ebakuntza faltsuko taldeko irudietan. (B) ME taldeko orno-gorputzaren seinale-ezaugarriak ebakuntza faltsuko taldekoen antzekoak dira, eta ez da seinale-aldaketa esanguratsurik ikusten denboran zehar txertatze-gunean. (C) NPE taldean, seinale baxua argi ikusten da T1W sekuentzian, eta seinale mistoa eta seinale baxua argi ikusten dira T2W sekuentzian. 12 asteko alditik 20 asteko aldira, T2W sekuentziako seinale baxuak inguratzen dituzten seinale altu esporadikoak gutxitu egiten dira.
NPE taldean hezur-hiperplasia agerikoa ikus daiteke orno-gorputzaren inplantazio-gunean, eta hezur-hiperplasia azkarrago gertatzen da 12tik 20 astera (2C irudia) NPE taldearekin alderatuta, ez da aldaketa esanguratsurik ikusten modelatutako orno-gorputzetan; Sham taldea eta ME taldea (2C irudia) 2A,B).
(A) Orno-gorputzaren gainazala txertatutako zatian oso leuna da, zuloa ondo sendatzen da eta ez dago hiperplasiarik orno-gorputzean. (B) ME taldean txertatutako gunearen forma ebakuntza faltsuaren taldekoaren antzekoa da, eta ez dago txertatutako gunearen itxuran aldaketa nabarmenik denboran zehar. (C) NPE taldean hezur-hiperplasia gertatu zen txertatutako gunean. Hezur-hiperplasia azkar handitu zen eta ornoarteko diskotik zehar kontrako orno-gorputzeraino ere hedatu zen.
Analisi histologikoak hezur-formazioari buruzko informazio zehatzagoa eskaintzen du. 3. irudiak H&E-rekin tindatutako ebakuntza osteko atalen argazkiak erakusten ditu. Ebakuntza faltsuko taldean, kondrozitoak ondo antolatuta zeuden eta ez zen zelulen ugalketarik detektatu (3A irudia). ME taldeko egoera ebakuntza faltsuko taldekoaren antzekoa zen (3B irudia). Hala ere, NPE taldean, kondrozito kopuru handia eta NP itxurako zelulen ugalketa ikusi ziren inplantazio-gunean (3C irudia);
(A) Trabekulak muturreko plakaren ondoan ikus daitezke, kondrozitoak txukun antolatuta daude, zelula tamaina eta forma uniformeekin eta ugalketarik gabe (40 aldiz). (B) ME taldeko inplantazio gunearen egoera talde faltsuarenaren antzekoa da. Trabekulak eta kondrozitoak ikus daitezke, baina ez dago ugalketa nabarmenik inplantazio gunean (40 aldiz). (B) Kondrozitoak eta NP antzeko zelulak nabarmen ugaltzen direla ikus daiteke, eta kondrozitoen forma eta tamaina irregularrak direla (40 aldiz).
Interleukin 4 (IL-4) mRNA, interleukin 17 (IL-17) mRNA eta interferon γ (IFN-γ) mRNAren adierazpena NPE eta ME taldeetan ikusi zen. Gene helburuen adierazpen mailak alderatu zirenean, IL-4, IL-17 eta IFN-γ geneen adierazpenak nabarmen handitu ziren NPE taldean ME taldekoekin eta eragiketa faltsuko taldekoekin alderatuta (4. irudia) (P < 0,05). Eragiketa faltsuko taldearekin alderatuta, IL-4, IL-17 eta IFN-γ-ren adierazpen mailak ME taldean apur bat baino ez ziren handitu eta ez zuten aldaketa estatistikorik lortu (P > 0,05).
IL-4, IL-17 eta IFN-γ mRNAren adierazpenak NPE taldean joera nabarmen handiagoa erakutsi zuen eragiketa faltsuko taldekoekin eta ME taldekoekin alderatuta (P < 0,05).
Aldiz, ME taldeko adierazpen-mailek ez zuten alde esanguratsurik erakutsi (P>0,05).
Western blot analisia IL-4 eta IL-17ren aurkako antigorputz komertzialak erabiliz egin zen, mRNAren adierazpen-eredu aldatua berresteko. 5A eta 5B irudietan ikusten den bezala, ME taldearekin eta eragiketa faltsuko taldearekin alderatuta, IL-4 eta IL-17 proteina-mailak NPE taldean nabarmen handitu ziren (P < 0,05). Eragiketa faltsuko taldearekin alderatuta, IL-4 eta IL-17 proteina-mailak ME taldean ere ez ziren aldaketa estatistikoki esanguratsuak lortu (P> 0,05).
(A) IL-4 eta IL-17 proteina mailak NPE taldean ME taldekoak eta plazebo taldekoak baino nabarmen handiagoak izan ziren (P < 0,05). (B) Western blot histograma.
Kirurgian zehar lortutako giza lagin kopuru mugatua dela eta, MCren patogenesiari buruzko ikerketa argi eta zehatzak egitea zaila da neurri batean. MCren animalia-eredu bat ezartzen saiatu ginen bere mekanismo patologiko potentzialak aztertzeko. Aldi berean, ebaluazio erradiologikoa, ebaluazio histologikoa eta ebaluazio biologiko molekularra erabili ziren NP autoinjertoak eragindako MCren bilakaera jarraitzeko. Ondorioz, NP inplantazio-ereduak seinale-intentsitatearen aldaketa mailakatua eragin zuen 12 astetik 20 astera (seinale baxua mistoa T1W sekuentzietan eta seinale baxua T2W sekuentzietan), ehunen aldaketak adieraziz, eta ebaluazio histologiko eta biologiko molekularrek azterketa erradiologikoaren emaitzak berretsi zituzten.
Esperimentu honen emaitzek erakusten dute NPE taldean orno-gorputzaren hausturaren gunean aldaketa bisual eta histologikoak gertatu zirela. Aldi berean, IL-4, IL-17 eta IFN-γ geneen adierazpena ikusi zen, baita IL-4, IL-17 eta IFN-γ ere, eta horrek adierazten du orno-gorputzean nukleo pulposo autologoaren ehunaren hausturak seinale eta aldaketa morfologiko sorta bat eragin dezakeela. Erraza da ikustea animalia-ereduaren orno-gorputzen seinale-ezaugarriak (seinale baxua T1W sekuentzian, seinale mistoa eta seinale baxua T2W sekuentzian) oso antzekoak direla gizakien orno-zelulenekin, eta MRI ezaugarriek ere histologiaren eta anatomia gordinaren behaketak berresten dituzte, hau da, orno-gorputzeko zelulen aldaketak progresiboak direla. Trauma akutuak eragindako hanturazko erantzuna zulaketa egin eta berehala ager daitekeen arren, MRI emaitzek erakutsi zuten seinale-aldaketa progresiboak agertu zirela zulaketa egin eta 12 astera eta 20 astera arte iraun zutela MRI aldaketen suspertze edo alderantzikapen zantzurik gabe. Emaitza hauek iradokitzen dute orno-NP autologoa metodo fidagarria dela untxietan MV progresiboa ezartzeko.
Zulaketa-eredu honek trebetasun, denbora eta kirurgia-ahalegin egokia eskatzen du. Aurretiazko esperimentuetan, paravertebral lotailu-egituren disekzioak edo gehiegizko estimulazioak orno-osteofitoak eratzea eragin dezake. Kontuz ibili behar da ondoko diskoak ez kaltetzeko edo narritatzeko. Emaitza koherenteak eta erreproduzigarriak lortzeko sartze-sakonera kontrolatu behar denez, eskuz tapoi bat egin genuen 3 mm-ko luzera zuen orratz baten zorroa moztuz. Tapoi hau erabiliz, orno-gorputzean zulaketa-sakonera uniformea bermatzen da. Aurretiazko esperimentuetan, ebakuntzan parte hartu zuten hiru ortopedia-zirujauk aurkitu zuten 16 kalibreko orratzak errazagoak zirela erabiltzeko 18 kalibreko orratzak edo beste metodo batzuk baino. Zulaketa-prozesuan odoljario gehiegirik ez izateko, orratza denbora batez geldirik edukitzeak txertatze-zulo egokiagoa emango du, eta horrek iradokitzen du MC maila jakin bat kontrola daitekeela modu honetan.
Ikerketa askok MC aztertu duten arren, gutxi dakigu MCren etiologia eta patogenesiari buruz25,26,27. Aurreko ikerketetan oinarrituta, ikusi genuen autoimmunitateak funtsezko zeregina duela MC12ren agerpenean eta garapenean. Ikerketa honek IL-4, IL-17 eta IFN-γ-ren adierazpen kuantitatiboa aztertu zuen, eta hauek dira CD4+ zelulen bereizketa bide nagusiak antigenoen estimulazioaren ondoren. Gure ikerketan, talde negatiboarekin alderatuta, NPE taldeak IL-4, IL-17 eta IFN-γ-ren adierazpen handiagoa izan zuen, eta IL-4 eta IL-17 proteina mailak ere altuagoak izan ziren.
Klinikoki, IL-17 mRNAren adierazpena handitu egiten da disko-hernia duten pazienteen NP zeluletan28. IL-4 eta IFN-γ adierazpen mailak handitu egin dira disko-hernia ez-konpresibo akutu batean ere, kontrol osasuntsuekin alderatuta29. IL-17k funtsezko zeregina du hanturan, ehunen lesioan gaixotasun autoimmuneetan30 eta IFN-γ-rekiko erantzun immunologikoa hobetzen du31. IL-17k eragindako ehunen lesio hobetua jakinarazi da MRL/lpr saguetan32 eta autoimmunitatearekiko sentikorrak diren saguetan33. IL-4k zitokina proinflamatorioen adierazpena (IL-1β eta TNFα bezalakoak) eta makrofagoen aktibazioa inhibitzen ditu34. Jakinarazi zen IL-4ren mRNAren adierazpena desberdina zela NPE taldean IL-17 eta IFN-γ-rekin alderatuta une berean; IFN-γ-ren mRNAren adierazpena NPE taldean beste taldeetakoa baino nabarmen handiagoa izan zen. Beraz, IFN-γ ekoizpena NP interkalazioak eragindako erantzun inflamatorioaren bitartekaria izan daiteke. Ikerketek erakutsi dute IFN-γ hainbat zelula motak sortzen dutela, besteak beste, 1 motako T laguntzaile zelula aktibatuek, hiltzaile naturalen zelulek eta makrofagoek35,36, eta erantzun immunologikoak sustatzen dituen hanturazko zitokina gakoa dela37.
Ikerketa honek iradokitzen du erantzun autoimmuneak parte hartu dezakeela MCren agerpenean eta garapenean. Luoma et al.-ek aurkitu zuten MCren eta NP nabarmenaren seinale-ezaugarriak antzekoak direla MRIan, eta biek seinale altua erakusten dutela T2W sekuentzian38. Zitokina batzuk MCren agerpenarekin estuki lotuta daudela baieztatu da, hala nola IL-139. Ma et al.-ek iradoki zuten NPren goranzko edo beheranzko irtenguneak eragin handia izan dezakeela MCren agerpenean eta garapenean12. Bobechko40 eta Herzbein et al.41-ek jakinarazi zuten NP ehun immunotolerantea dela, eta ezin dela jaiotzetik zirkulazio baskularrean sartu. NPren irtenguneek gorputz arrotzak sartzen dituzte odol-horniduran, eta horrela, tokiko erreakzio autoimmuneak bitartekatzen dituzte42. Erreakzio autoimmuneek faktore immune ugari eragin ditzakete, eta faktore horiek ehunen eraginpean daudenean, seinaleztapenean aldaketak eragin ditzakete43. Ikerketa honetan, IL-4, IL-17 eta IFN-γ-ren gehiegizko adierazpena faktore immune tipikoak dira, eta horrek are gehiago frogatzen du NPren eta MCen arteko harreman estua44. Animalia-eredu honek NP-ren aurrerapena eta plaka terminalean sartzea imitatzen ditu. Prozesu honek autoimmunitateak MC-an duen eragina are gehiago agerian utzi zuen.
Espero bezala, animalia-eredu honek MC aztertzeko plataforma posible bat eskaintzen digu. Hala ere, eredu honek oraindik muga batzuk ditu: lehenik eta behin, animalien behaketa-fasean, tarteko faseko untxi batzuk eutanasiatu behar dira histologia eta biologia molekularreko probak egiteko, beraz, animalia batzuk "erabiltzeari uzten" diote denborarekin. Bigarrenik, ikerketa honetan hiru denbora-puntu ezarri diren arren, zoritxarrez, MC mota bakarra modelatu dugu (Modic I motako aldaketa), beraz, ez da nahikoa gizakien gaixotasunen garapen-prozesua irudikatzeko, eta denbora-puntu gehiago ezarri behar dira seinale-aldaketa guztiak hobeto behatzeko. Hirugarrenik, ehunen egituraren aldaketak argi eta garbi erakuts daitezke tindaketa histologikoaren bidez, baina teknika espezializatu batzuek hobeto agerian utzi ditzakete eredu honetako mikroegitura-aldaketak. Adibidez, argi polarizatuko mikroskopia erabili zen untxien ornoarteko diskoetan fibrokartilagoaren eraketa aztertzeko45. NP-k MCan eta muturreko plakan dituen epe luzeko ondorioek azterketa gehiago behar dute.
Zeelanda Berriko berrogeita hamalau untxi zuri ar (2,5-3 kg inguruko pisua, 3-3,5 hilabeteko adina) ausaz banatu ziren ebakuntza faltsuko taldean, gihar inplantazio taldean (ME taldea) eta nerbio-sustraien inplantazio taldean (NPE taldea). Prozedura esperimental guztiak Tianjin Ospitaleko Etika Batzordeak onartu zituen, eta metodo esperimentalak onartutako jarraibideen arabera egin ziren.
S. Sobajimaren kirurgia-teknikan hobekuntza batzuk egin dira 46. Untxi bakoitza alboko etzandako posizioan jarri zen eta bost ornoarteko disko gerriarren (IVD) aurreko gainazala agerian geratu zen, peritoneo-aurreko hurbilketa posterolaterala erabiliz. Untxi bakoitzari anestesia orokorra eman zitzaion (% 20ko uretanoa, 5 ml/kg belarriko zainaren bidez). Saihetsen beheko ertzetik pelbisaren ertzeraino luzetarako azaleko ebaki bat egin zen, 2 cm paravertebral muskuluetatik bentralki. L1etik L6ra bitarteko eskuineko bizkarrezurra anterolaterala agerian geratu zen, gaineko ehun subkutaneoaren, ehun retroperitonealaren eta muskuluen disekzio zorrotz eta kamutsaren bidez (6A irudia). Diskoaren maila pelbisaren ertza L5-L6 diskoaren mailaren mugarri anatomiko gisa erabiliz zehaztu zen. Erabili 16 kalibreko zulaketa-orratz bat L5 ornoaren mutur-plakaren ondoan 3 mm-ko sakonerako zulo bat zulatzeko (6B irudia). Erabili 5 ml-ko xiringa bat L1-L2 ornoarteko diskoko nukleo pulposo autologoa aspiratzeko (6C irudia). Kendu nukleo pulposoa edo muskulua talde bakoitzaren beharren arabera. Zuloa sakondu ondoren, jostura xurgagarriak jartzen dira faszia sakonean, faszia azalekoan eta azalean, kontuz ibiliz orno-gorputzeko ehun periostikoa ez kaltetzeko ebakuntzan zehar.
(A) L5-L6 diskoa atzeko eta atzerako peritoneoko hurbilketa baten bidez azaleratzen da. (B) 16 kalibreko orratz bat erabili L5 muturreko plakaren ondoan zulo bat egiteko. (C) MF autologoak biltzen dira.
Anestesia orokorra eman zen % 20ko uretanoarekin (5 ml/kg) belarriko zainaren bidez emanez, eta bizkarrezurraren gerrialdeko erradiografiak errepikatu ziren ebakuntzaren ondorengo 12, 16 eta 20 asteetan.
Untxiak ketamina (25,0 mg/kg) eta sodio pentobarbital zain barnekoa (1,2 g/kg) injektatuz sakrifikatu ziren ebakuntzaren ondorengo 12, 16 eta 20 asteetan. Bizkarrezurra osoa kendu zen analisi histologikoa egiteko eta benetako analisia egin zen. Alderantzizko transkripzio kuantitatiboa (RT-qPCR) eta Western blotting erabili ziren faktore immuneetan izandako aldaketak detektatzeko.
MRI azterketak untxiei egin zitzaizkien 3.0 T-ko iman kliniko bat (GE Medical Systems, Florence, SC) erabiliz, gorputz-adarren bobina ortogonalaren hartzaile batekin hornitua. Untxiak % 20ko uretanoarekin (5 mL/kg) anestesiatu ziren belarriko zainaren bidez eta ondoren etzanda jarri ziren imanaren barruan, gerrialdeko eskualdea 5 hazbeteko diametroko gainazaleko bobina zirkular batean zentratuta (GE Medical Systems). T2-pisatutako lokalizatzailearen irudi koronalak (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) eskuratu ziren gerrialdeko diskoaren kokapena L3-L4tik L5-L6ra definitzeko. Plano sagitaleko T2-pisatutako ebakiak eskuratu ziren ezarpen hauekin: spin-echo sekuentzia azkarra, 2200 ms-ko errepikapen-denborarekin (TR) eta 70 ms-ko oihartzun-denborarekin (TE), matrizea; 260ko ikusmen-eremua eta zortzi estimulu; Ebaketaren lodiera 2 mm-koa zen, tartea 0.2 mm-koa.
Azken argazkia atera eta azken untxia hil ondoren, disko faltsua, giharretakoa eta NP diskoak kendu ziren azterketa histologikorako. Ehunak % 10eko formalina neutro tamponatuan finkatu ziren astebetez, azido etilendiaminotetraazetikoarekin deskalzifikatu eta parafinarekin sekzioatu ziren. Ehun-blokeak parafinarekin txertatu eta mikrotomo bat erabiliz sekzio sagitaletan (5 μm-ko lodierakoak) moztu ziren. Atalak hematoxilina eta eosinarekin (H&E) tindatu ziren.
Talde bakoitzeko untxien ornoarteko diskoak bildu ondoren, RNA osoa erauzi zen UNIQ-10 zutabe bat erabiliz (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Txina), fabrikatzailearen argibideen arabera eta ImProm II alderantzizko transkripzio sistema bat erabiliz (Promega Inc., Madison, WI, AEB). Alderantzizko transkripzioa egin zen.
RT-qPCR Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., AEB) eta SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AEB) erabiliz egin zen, fabrikatzailearen argibideen arabera. PCR erreakzio-bolumena 20 μl izan zen eta 1,5 μl cDNA diluitu eta primer bakoitzaren 0,2 μM zituen. Primerrak OligoPerfect Designer-ek (Invitrogen, Valencia, CA) diseinatu zituen eta Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd.-ek (Txina) fabrikatu zituen (1. taula). Ziklo termikoen baldintza hauek erabili ziren: hasierako polimerasaren aktibazio-urratsa 94 °C-tan 2 minutuz, ondoren 40 ziklo 15 segundokoak 94 °C-tan txantiloiaren desnaturalizaziorako, 60 °C-tan minutuz berotzea, luzapena eta fluoreszentzia. Neurketak 72 °C-tan minutuz egin ziren. Lagin guztiak hiru aldiz anplifikatu ziren eta batez besteko balioa erabili zen RT-qPCR analisietarako. Anplifikazio datuak FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, AEB) erabiliz aztertu ziren. IL-4, IL-17 eta IFN-γ geneen adierazpena kontrol endogenoarekiko (ACTB) normalizatu zen. mRNA helburuaren adierazpen maila erlatiboak 2-ΔΔCT metodoa erabiliz kalkulatu ziren.
Proteina osoa ehunetatik erauzi zen ehunen homogeneizatzaile bat erabiliz RIPA lisi bufferran (proteasa eta fosfatasa inhibitzaile koktel bat duena) eta ondoren 13.000 rpm-tan zentrifugatu zen 20 minutuz 4 °C-tan ehunen hondakinak kentzeko. Berrogeita hamar mikrogramo proteina kargatu ziren errei bakoitzeko, % 10eko SDS-PAGE bidez bereizi ziren, eta ondoren PVDF mintz batera transferitu ziren. Blokeoa % 5eko esne gaingabetu lehorrean egin zen Tris-buffered salinean (TBS), % 0,1 Tween 20 zuena, ordubetez giro-tenperaturan. Mintza untxiaren anti-dekorinaren lehen mailako antigorputzarekin (1:200 diluitua; Boster, Wuhan, Txina) (1:200 diluitua; Bioss, Beijing, Txina) inkubatu zen gau osoan 4 °C-tan eta bigarren egunetan erreakzionatu egin zen; bigarren mailako antigorputzarekin (ahuntz anti-untxi immunoglobulina G 1:40.000 diluzioan) errefau peroxidasarekin (Boster, Wuhan, Txina) konbinatuta ordubetez giro-tenperaturan. Western blot seinaleak detektatu ziren kimiolumineszentzia handituz kimiolumineszente mintzean X izpien irradiazioaren ondoren. Densitometriako analisirako, blot-ak eskaneatu eta kuantifikatu ziren BandScan softwarea erabiliz eta emaitzak helburuko genearen immunerreaktibotasunaren eta tubulinaren immunerreaktibotasunaren arteko erlazio gisa adierazi ziren.
Kalkulu estatistikoak SPSS16.0 software paketea (SPSS, AEB) erabiliz egin ziren. Ikerketan zehar bildutako datuak batez besteko ± desbideratze estandar gisa adierazi ziren (batez bestekoa ± SD) eta bariantzaren neurri errepikatuen analisi unidirekzionala (ANOVA) erabiliz aztertu ziren bi taldeen arteko desberdintasunak zehazteko. P < 0,05 estatistikoki esanguratsutzat jo zen.
Horrela, MCren animalia-eredu bat ezartzea, NP autologoak orno-gorputzean txertatuz eta behaketa makroanatomikoa, MRI analisia, ebaluazio histologikoa eta analisi biologiko molekularra eginez, tresna garrantzitsua izan daiteke gizakien MCren mekanismoak ebaluatu eta ulertzeko eta esku-hartze terapeutiko berriak garatzeko.
Artikulu hau nola aipatu: Han, C. et al. Modic aldaketen animalia-eredu bat ezarri zen bizkarrezurraren bizkarrezurreko hezur subkondralean nukleo pulposo autologoa txertatuz. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., eta Boos, N. Bizkarrezurraren erresonantzia magnetikoaren irudia: disko-herniazio eta atxikipenaren prebalentzia, nerbio-erroen konpresioa, muturreko plakaren anomaliak eta fasete-artikulazioetako osteoartritisa boluntario asintomatikoetan. tasa. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, eta Leboeuf-Eed, K. Aldaketa modikoak eta aurkikuntza klinikoekin duten erlazioa. European Spine Journal: European Spine Society, European Society of Spinal Deformity eta European Society for Cervical Spine Research-en argitalpen ofiziala 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., et al. Gerrialdeko ornoen muturreko plaken aldaketa modikoak: adin ertaineko gizonezko langileen bizkarreko behealdeko minarekin eta ziatikarekin duten prebalentzia eta lotura. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., eta Dalinka, M. Bizkarrezurraren endekapenezko gaixotasunetan muturreko plakaren ondoan dauden hezur-muineko aldaketen erresonantzia magnetikoa. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, eta Carter, JR Disko-gaixotasun degeneratiboa: orno-muinaren aldaketen ebaluazioa MRI bidez. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS, eta Carter, JR Disko-gaixotasun degeneratiboaren irudigintza. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, et al. Neovertebral end plate-aren (Modic) aurreikusleek aldaketak adierazten dituzte populazio orokorrean. European Spine Journal: European Spine Society, European Society of Spinal Deformity eta European Society for Cervical Spine Research-en argitalpen ofiziala, 19. dibisioa, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB eta Mannisch, K. Disko-herniazio gerriaren ondoren gertatzen diren aldaketa modikoak. European Spine Journal: European Spine Society, European Society of Spinal Deformity eta European Society for Cervical Spine Research-en argitalpen ofiziala 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., eta Kaapa, E. I motako aldaketek disko deformazionalen endekapen azkar eta progresiboa aurreikus dezakete: urtebeteko ikerketa prospektiboa. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ eta Fan, SW Aldaketa modikoak: gerrialdeko diskoen endekapenean izan dezaketen arrazoiak eta ekarpena. Hipotesi Medikoak 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Barneko disko-haustura. Disko-prolapsoaren arazoak 50 urte baino gehiagotan. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Argitaratze data: 2024ko abenduaren 13a